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clark2010金虫 (小有名气)
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双酶切经验分享 已有1人参与
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前段时间做了双酶切后连接，载体7.5 Kb （小片段只有300 bp）， 连接用片段是从T载体上切下来的，分别是1 Kb，1.5 Kb，和2 Kb，fermentas的fast酶，切了15min后胶回收，连接转化之后挑单菌验证，各挑两个转化子，结果发现只有1 Kb的片段连上了，其余4个都是载体自连。 第二次做的时候两个酶的用量都减半，然后将反应时间延长到1 h，最后挑了6个转化子，验证全部正确。 个人认为可能的原因： 在说明书上写了酶的用量加起来不能超过总体积的1/10，而两个都按20 uL体系加1 uL酶的话，如果枪尖沾点甘油，打进去就超过1/10了，可能会影响某些酶的效率，酶的用量减半可以解决这个问题。而延长反应时间可以弥补酶量不足的问题，所以可以得到比较好的结果。 个人意见，请大家讨论。 |
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