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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请教测序结果!出现碱基突变和缺失了
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well_想太多

新虫 (小有名气)

[求助] 请教测序结果!出现碱基突变和缺失了 已有1人参与

我用自己设计的引物扩增一段cds序列,结果出来了与已知的cds序列比对发现有一个碱基的缺失和17个碱基的突变,我想问下,这样能直接往下面做克隆,表达吗?还是需要再重新pcr一下?主要我怕后面做表达会出现蛋白表达不正确的情况
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1楼 2014-09-07 11:49:14
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xiaomdj

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-07 17:28:26
当然要重新pcr，否则后续实验可能遇到麻烦

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-09-07 12:00:53
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaomdj at 2014-09-07 12:00:53
当然要重新pcr，否则后续实验可能遇到麻烦

那需要在哪些方面注意呢?我的循环次数是35,我看论坛里其他前辈说30就够了
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3楼2014-09-07 12:25:35
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
30个循环确实够了，可以换高保真酶扩增（连接T载体时注意加A尾）
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。
4楼2014-09-07 14:03:10
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-07 14:03:10
30个循环确实够了，可以换高保真酶扩增（连接T载体时注意加A尾）

我是pcr产物直接测序的,前两次做的时候也用高保真酶了,可是条带的亮度没有用rTaq好,所以测序的时候就用的是rTaq酶的产物测序.有17个碱基突变了,是不是相对来说这样后面蛋白的改变是致命的?
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5楼2014-09-07 16:50:14
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
well_想太多(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-07 20:55:05
西门吹雪170: 应助指数+1 2014-09-07 20:55:23
well_想太多: 金币+3, ★有帮助 2014-09-07 21:54:07
碱基缺失了才是致命的，缺失后面的全部移码了，你去把测过的序列翻译成氨基酸看一下和原来的氨基酸序列比对一下，就知道这条序列行不行了
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。
6楼2014-09-07 18:22:45
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
对了，你用PCR产物测序，是不是双向测的，还有如果你的片段大于800bp后数据就不太可靠了，得设计引物继续测。
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。
7楼2014-09-07 18:25:46
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 我欲乘风归去 at 2014-09-07 18:25:46
对了，你用PCR产物测序，是不是双向测的，还有如果你的片段大于800bp后数据就不太可靠了，得设计引物继续测。

是双向测通的,片段大小900bp左右.我翻译了一下序列,确实出现氨基酸的突变了,看来是不能用了,重新再测一下吧.
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8楼2014-09-07 21:53:51
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shengwumin

金虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-08 12:41:18
楼主忽略了一个问题：可能不是PCR的问题，问题的根本原因就是你用的样品中此基因是不是就是突变的。你有检测过他的蛋白水平吗？或者有文献报道他吗？
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believeyourself! come on .
9楼2014-09-08 09:59:21
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shengwumin

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by well_想太多 at 2014-09-07 21:53:51
是双向测通的,片段大小900bp左右.我翻译了一下序列,确实出现氨基酸的突变了,看来是不能用了,重新再测一下吧....

没有问题的 我测过1200多bp的，照样出来的序列很好，关键是你的样品问题。
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believeyourself! come on .
10楼2014-09-08 10:00:33
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