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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] pet-28b载体lacI缺失两个碱基会导致什么结果

在用pet-28b载体和BL21（DE3）宿主菌构建工程菌之后，测序发现pet-28b质粒上lacI基因缺失了两个碱基，这与我的目的蛋白不表达有关系么？
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1楼2013-12-09 10:19:47
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gyesang

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【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-09 12:29:50
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的，lacI缺失两个碱基，那会造成LacI基因的移码突变的，LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达，从而起不到诱导表达的作用
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2楼2013-12-09 11:30:35
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 11:30:35
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的，lacI缺失两个碱基，那会造成LacI基因的移码突变的，LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达，从而起不到诱导表达的作用

宿主菌和质粒上都含有lacI基因，以前我理解的是宿主菌产生的lacI阻遏蛋白与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子结合，而IPTG和lac I阻遏蛋白结合后失去对lac UV5的作用，因此可以启动T7 RNA聚合酶的表达，使目的蛋白表达，这样理解不对是么？lac I阻遏蛋白是质粒上的lac I基因产生的？
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3楼2013-12-09 12:16:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-09 14:21:38
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-09 16:56:26
lacI同时抑制 T7 promoter和T7的lacUV5两个启动子
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4楼2013-12-09 12:32:28
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gyesang

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【答案】应助回帖

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574759350: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-12-09 16:56:08
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3楼: Originally posted by 574759350 at 2013-12-09 12:16:16
宿主菌和质粒上都含有lacI基因，以前我理解的是宿主菌产生的lacI阻遏蛋白与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子结合，而IPTG和lac I阻遏蛋白结合后失去对lac UV5的作用，因此可以启动T7 RNA聚合酶的表达，使目的蛋 ...

更正我上面错误的说法，
表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因，其表达的LacI蛋白在非诱导的条件下，既可以与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子后的operator O结合，也可以与pET28a载体T7启动子后的Operator O结合，从而在非诱导情况下阻遏目的基因表达
虽然pET-28a载体的LacI发生碱基缺失突变，由于细菌基因组本身仍能表达正常的LacI，所以总的来说在非诱导情况下仍能阻遏蛋白表达

这两个碱基的缺失与你的蛋白不表达无关
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5楼2013-12-09 14:35:21
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 14:35:21
更正我上面错误的说法，
表达菌株BL21(DE3)上带有lacI基因，其表达的LacI蛋白在非诱导的条件下，既可以与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子后的operator O结合，也可以与pET28a载体T7启动子后的Operator O结合， ...

"由于细菌基因组本身仍能表达正常的LacI，所以总的来说在非诱导情况下仍能阻遏蛋白表达"

这个如果genome里面是lacIwt,表达量非常低，抑制很差（大概能抑制个20%就不错了），不用指望，如果是lacIq，还凑合。

wtPLac promoter 有LacO1 O2 O3三个 binding site 形成DNA loop，同时还需要crp激活，动力学和lacUV5 T7差别很大。
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6楼2013-12-10 01:08:53
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gyesang

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6楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-12-10 01:08:53
"由于细菌基因组本身仍能表达正常的LacI，所以总的来说在非诱导情况下仍能阻遏蛋白表达"

这个如果genome里面是lacIwt,表达量非常低，抑制很差（大概能抑制个20%就不错了），不用指望，如果是lacIq，还 ...

BL21(DE3)

F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

    an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq
    Transformed plasmids containing T7 promoter driven expression are repressed until IPTG induction of T7 RNA polymerase from a lac promoter.
    Derived from B834 (Wood, 1966) by transducing to Met+.
    See the original Studier paper or the summary in Methods in Enzymology for more details.
    Whole genome sequence available [3]
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7楼2013-12-10 15:00:37
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-10 15:00:37
BL21(DE3)

F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 )

    an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq
    Transformed plasmids containing T7 pro ...

加上de3里面的lacI就是2copy的wtlacI，是完全不够抑制的，
wtlacI大概要10-20copy左右才能有效抑制 Plac类promoter的活性
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8楼2013-12-11 03:01:35
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gyesang

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8楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-12-11 03:01:35
加上de3里面的lacI就是2copy的wtlacI，是完全不够抑制的，
wtlacI大概要10-20copy左右才能有效抑制 Plac类promoter的活性...

BL21（DE3）an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq，
你认为lacIq是wt的？
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9楼2013-12-11 03:24:28
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Haibara_Ai

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9楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-11 03:24:28
BL21（DE3）an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq，
你认为lacIq是wt的？...

1.genotype里写得是wtlacI，介绍里才写得Iq
2.NCBI 里organism里选择 Escherichia coli BL21(DE3) (taxid:469008)
用lacIq的promoter  blast

Query  1       GACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  54
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  748652  GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  748705

Query  1       GACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  54
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  337117  GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  337064

其中第一段是DE3integration  第二段是genome，其中-35区的
gtgcaa是LacIq promoter  gcgcaa是wt，按照这个序列，在BL21 de3里面是两段wtlacI, 当然我自己没有做过实验验证这个。
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10楼2013-12-11 07:05:49
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