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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] pet-28b载体lacI缺失两个碱基会导致什么结果

在用pet-28b载体和BL21（DE3）宿主菌构建工程菌之后，测序发现pet-28b质粒上lacI基因缺失了两个碱基，这与我的目的蛋白不表达有关系么？
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1楼 2013-12-09 10:19:47
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-12-10 01:08:53
"由于细菌基因组本身仍能表达正常的LacI，所以总的来说在非诱导情况下仍能阻遏蛋白表达"

这个如果genome里面是lacIwt,表达量非常低，抑制很差（大概能抑制个20%就不错了），不用指望，如果是lacIq，还 ...

BL21(DE3)

F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

    an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq
    Transformed plasmids containing T7 promoter driven expression are repressed until IPTG induction of T7 RNA polymerase from a lac promoter.
    Derived from B834 (Wood, 1966) by transducing to Met+.
    See the original Studier paper or the summary in Methods in Enzymology for more details.
    Whole genome sequence available [3]
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7楼2013-12-10 15:00:37
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-09 12:29:50
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的，lacI缺失两个碱基，那会造成LacI基因的移码突变的，LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达，从而起不到诱导表达的作用
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2楼2013-12-09 11:30:35
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 11:30:35
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的，lacI缺失两个碱基，那会造成LacI基因的移码突变的，LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达，从而起不到诱导表达的作用

宿主菌和质粒上都含有lacI基因，以前我理解的是宿主菌产生的lacI阻遏蛋白与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子结合，而IPTG和lac I阻遏蛋白结合后失去对lac UV5的作用，因此可以启动T7 RNA聚合酶的表达，使目的蛋白表达，这样理解不对是么？lac I阻遏蛋白是质粒上的lac I基因产生的？
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3楼2013-12-09 12:16:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-09 14:21:38
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-09 16:56:26
lacI同时抑制 T7 promoter和T7的lacUV5两个启动子
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4楼2013-12-09 12:32:28
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