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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] pet-28b载体lacI缺失两个碱基会导致什么结果

在用pet-28b载体和BL21(DE3)宿主菌构建工程菌之后,测序发现pet-28b质粒上lacI基因缺失了两个碱基,这与我的目的蛋白不表达有关系么?
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-11 03:24:28
BL21(DE3)an E. coli B strain with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIq,
你认为lacIq是wt的?...

1.genotype里写得是wtlacI,介绍里才写得Iq
2.NCBI 里organism里选择 Escherichia coli BL21(DE3) (taxid:469008)
用lacIq的promoter  blast

Query  1       GACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  54
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  748652  GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  748705

Query  1       GACACCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  54
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  337117  GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAA  337064

其中第一段是DE3integration  第二段是genome,其中-35区的
gtgcaa是LacIq promoter  gcgcaa是wt,按照这个序列,在BL21 de3里面是两段wtlacI, 当然我自己没有做过实验验证这个。
10楼2013-12-11 07:05:49
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2013-12-09 12:29:50
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的,lacI缺失两个碱基,那会造成LacI基因的移码突变的,LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达,从而起不到诱导表达的作用
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-12-09 11:30:35
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574759350

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-09 11:30:35
pET系列载体的基因诱导表达是受T7 RNA polymerase和LacI阻遏双重控制的,lacI缺失两个碱基,那会造成LacI基因的移码突变的,LacI就不能阻遏T7 RNA polymerase的表达,从而起不到诱导表达的作用

宿主菌和质粒上都含有lacI基因,以前我理解的是宿主菌产生的lacI阻遏蛋白与T7 RNA polymerase前的lac UV5启动子结合,而IPTG和lac I阻遏蛋白结合后失去对lac UV5的作用,因此可以启动T7 RNA聚合酶的表达,使目的蛋白表达,这样理解不对是么?lac I阻遏蛋白是质粒上的lac I基因产生的?
3楼2013-12-09 12:16:16
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-12-09 14:21:38
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-09 16:56:26
lacI同时抑制 T7 promoter和T7的lacUV5两个启动子
4楼2013-12-09 12:32:28
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