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sonhey金虫 (小有名气)
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关于酶切以后自连的问题 已有1人参与
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| 最近我做质粒酶切第一次是我用双酶切，然后作对照实验 ，结果转化是对照长得比试验组还多。我想请教大家载体不同粘性末端连接的效率高吗，为什么我每次作对照组时，都涨很多的菌呢（载体切过以后用胶回收回收的）。请贤能之士解答，谢谢！！！ |
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luwei13566
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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sonhey(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-01 13:03:27
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LZ现在的问题不是质粒双酶切出不同粘性末端之后的自连问题，而是你到底切没切出来两个粘性末端的问题，因为这两种情况在电泳图上是看不出来的。你这个对照是把质粒双酶切后不加基因直接转化的对照实验吧，这个算是个阴性对照，是专门用来判断你的载体是否完全双酶切开的，如果你的载体是完全被双酶切开后两边是不同的粘性末端，尽管不同的种类的粘性末端自连效率有差异，但总体来说再发生自连的效率很低。但是如果只切出来一个粘性末端，那自连效率当然高很多了。 从你的对照来看，如果你的你的质粒很可能只是一个内切酶线性化而另一个内切酶没有切割彻底的问题，你从对照组随便挑个转化子提质粒应该全是空载。 |
2楼2014-06-01 00:17:22