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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因，总是少28bp
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因，总是少28bp 已有7人参与

大家好，我克隆一个全长513bp的基因，连完载体菌液送测序总是少28bp，后来送PCR产物，发现也是少28bp,从条带上来看也看不出来，跑胶没有不特异的条带，有附图；最后一张附图是我截取的基因序列前面一部分，划线部分是缺失的28bp,另外缺失序列后面紧接着的28bp只有一个碱基不同，会不会测序有什么影响，另外缺失的碱基数不是3的倍数，很奇怪？谢谢大侠们了

克隆基因，总是少28bp
PCR全长.jpg


克隆基因，总是少28bp-1
酶切（ECOR1）.jpg


克隆基因，总是少28bp-2
基因部分序列.jpg
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分子生化实验经验积累 重复序列PCR扩增

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我是小女孩，让着我点！！！
1楼 2014-05-27 09:20:48
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
一桶稀泥(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-29 13:10:25
引用回帖:
9楼: Originally posted by 一桶稀泥 at 2014-05-28 00:04:59
不是同一材料呢，怎么看是否是单考贝呢，我将原序列在乎ncni中比对，选择黄瓜基因组对吗？
...

如果从不同品种来源的基因组，那很可能存在等位变异，因此可以从不同品种或不同基因型的黄瓜中克隆你的目的基因。
是否单拷贝可以如你所说的做，既然黄瓜基因组都测序完成，那这个基因应该很好查到定位的。也可以参考其它物种这个基因的相关研究。（拿到基因一般都要在NCBI里搜索一番，看看相关序列，然后做个系统分析，预测一下基因功能啥的。）
你的基因如果编码区真缺失了28bp，除非是不编码蛋白的基因，或者在内含子区，否则就是个假基因了吧。
如果重复PCR都缺失28bp，那就不是PCR问题了。
都不知道你的模板是基因组还是cDNA，如果cDNA就不存在内含子的因素了。
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15楼2014-05-28 12:49:18
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:13:16
可以看到图。你这个少的28bp的片段是在中间还是在首位啊？如果在首位的首位的话，我觉得可能和测序有关，建议你把目的片段连到载体上，然后用载体的通用引物为引物采用双向测序的方法对目的片段进行测序。
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learnenglish
3楼2014-05-27 11:08:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
一桶稀泥: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-10-08 22:24:51
这个问题无解，原因就是里面有个repeat,感觉当有两个repeat的时候，做PCR会跳过一个似的，不知道什么原因
这个问题我也遇到过，我克隆SV40的启动子，SV40启动子里面有个增强子，两个72bp的重复，做PCR，就是只能获得一个72bp，另外一个的repeat就是扩增不到
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2014-05-27 14:17:20
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
一桶稀泥(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-29 13:10:40
引用回帖:
14楼: Originally posted by 一桶稀泥 at 2014-05-28 07:53:26
我要做功能验证合成也行吗？
...

感觉你是想克隆这个基因做表达用的，你这个基因528bp不长，获得该基因除了从以cDNA为模板进行PCR扩增外，也可以去进行全基因合成

鉴于你这个问题，如果你实在是想通过自己分子克隆方法来解决这个重复序列PCR丢失问题也是可以的，不过比较复杂(不推荐这么做，技术上是可行的)，你可以从重复片段处分为上下两段，通过引入IIs限制性内切酶,如BsaI,BbsI等，分别回收PCR克隆前后两个片段，然后再通过限制性酶切将两个片段连接在一起。
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2014-05-28 17:49:26
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普通回帖

一桶稀泥

木虫 (正式写手)
想知道各位能看到图片吗？我怎么看不到，第一次发图片贴，请多多指教
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2楼2014-05-27 09:22:49
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 万丽丽081222 at 2014-05-27 11:08:41
可以看到图。你这个少的28bp的片段是在中间还是在首位啊？如果在首位的首位的话，我觉得可能和测序有关，建议你把目的片段连到载体上，然后用载体的通用引物为引物采用双向测序的方法对目的片段进行测序。

从起始密码子开始的第61个位置开始缺失，我截图的是从起始密码子开始的，我也链接到T3载体上了，正向测序结果是缺失的，没有试双向测序。测序可能性会不会很大呢？
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4楼2014-05-27 11:26:49
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 14:13:31
你展示的基因序列和你克隆基因所用的材料是相同来源的么？
这个基因在基因组中是单拷贝的么？
重复克隆如果都少，那可能是模板本身的问题
我的经验，测序出现缺失这么长片段的概率很低，几乎不可能。
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5楼2014-05-27 13:32:07
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-27 18:53:43
你有可能遇到重复序列之类的问题了，引物设计长点，试试

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7楼2014-05-27 16:13:24
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cuijinmiss

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物设计是不是有问题？如果引物有问题，会导致酶切位点的变化，出现切错的可能。
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8楼2014-05-27 17:07:28
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2014-05-27 13:32:07
你展示的基因序列和你克隆基因所用的材料是相同来源的么？
这个基因在基因组中是单拷贝的么？
重复克隆如果都少，那可能是模板本身的问题
我的经验，测序出现缺失这么长片段的概率很低，几乎不可能。

不是同一材料呢，怎么看是否是单考贝呢，我将原序列在乎ncni中比对，选择黄瓜基因组对吗？

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9楼2014-05-28 00:04:59
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cuijinmiss at 2014-05-27 17:07:28
引物设计是不是有问题？如果引物有问题，会导致酶切位点的变化，出现切错的可能。

上游从起始密码子开始一段，下游终子密码子开始的反向互补的一段，应该没问题，另外今天我用3%的胶电泳，发现确实在500以下，我用5个不同品种去pcr，结果都一样，在500一下，说明pcr出了问题，不知道怎么办才好

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10楼2014-05-28 00:09:37
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