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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因点突变如何解决
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] 克隆基因点突变如何解决

克隆基因连接T载体后测序，有点突变，应该从哪里改进？？？？？
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1楼 2012-12-16 18:06:53
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shujunru

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你重新做一遍PCR，使用高保真酶，注意说明书，象pfu是不能在扩增结束时加A的，不能做T载体连接；
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2楼2012-12-17 06:22:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果序列不长的话用taq没问题，再挑几个克隆去测序。不行的话重做PCR，循环数不要多。大片段用高保真酶做，P好后加A，再做TA克隆。
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3楼2012-12-17 09:31:20
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-17 09:31:20
如果序列不长的话用taq没问题，再挑几个克隆去测序。不行的话重做PCR，循环数不要多。大片段用高保真酶做，P好后加A，再做TA克隆。

循环30个算多吗？
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4楼2012-12-17 09:50:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by yuguiyan at 2012-12-17 09:50:00
循环30个算多吗？...

不算多，如果扩增效率不错的话可以用25个。
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5楼2012-12-17 13:06:30
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