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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆5KB左右的基因，两个多月了还没进展，求帮忙啊！！！！
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)

[求助] 克隆5KB左右的基因，两个多月了还没进展，求帮忙啊！！！！ 已有9人参与

本人是个新手，现在要克隆个5kb的基因，已经进行了两个多月了还没进展，不知道该怎么办，那位大侠能帮帮忙啊？
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1楼 2014-05-13 16:20:16
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回帖置顶 ( 共有3个 )

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 很赞同，要写的详细点，就一个做不出来，原因可能多了去了。 2014-05-16 13:11:39
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:53
新手克隆5k基因，2个月没有进展正常。如果你的实验室是小实验室，很少有人有克隆方面的经验的话，给你一年你未必能克隆出来。
把你实验的信息多写点上来，不然没法帮你。
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4楼2014-05-13 18:25:28
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:12:03
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:04
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

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12楼2014-05-15 15:06:42
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:17
引用回帖:
12楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-15 15:06:42
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

额，新手，不太会使用介个，见谅哈~
引物是上游：ctaaacgcgtaccggtcaat
         下游    ttctggcagcttttgtttcc
         模版：拟南芥基因组DNA
         酶：KOD -PLUS-NEO
        程序predenature:94度  2分钟
              denature:     98度  10秒
              annealing:     59度  30秒
             extension:      68度 2分30秒
            30个循环
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14楼2014-05-15 15:14:39
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普通回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-05-13 18:00:07
没进展是什么个情况，能说仔细点么?

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2楼2014-05-13 17:31:27
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luwei13566

木虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-05-15 16:02:30
基因够大的，你现在都做了哪几种方法做不出来啊？
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大家相互帮助哈
3楼2014-05-13 18:00:02
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DavinciTesla

铜虫 (初入文坛)
体液配方没弄好吧！

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5楼2014-05-13 18:31:25
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wakasasa

银虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-05-15 16:03:20
我克隆四k的没出来……然后克隆两k的扩增出来个四k的，奇葩不？

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445566
6楼2014-05-13 18:42:05
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DAX1

新虫 (小有名气)
★
米粒儿308(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-15 16:03:39
5k的确有点大，要是再遇上gc含量高的，或者引物设计区域重复多的话就更难的。建议楼主去mgc的cdna库看看，是否有你的全长基因，大概一个100多美金。如果你够幸运的话，在addgene里面说不定能找到别人提交的，这样就更便宜了，几十美金。
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7楼2014-05-13 19:21:12
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wakasasa at 2014-05-13 18:42:05
我克隆四k的没出来……然后克隆两k的扩增出来个四k的，奇葩不？

我扩了个6、7K的出来。。。。
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8楼2014-05-15 14:50:32
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-13 18:25:28
新手克隆5k基因，2个月没有进展正常。如果你的实验室是小实验室，很少有人有克隆方面的经验的话，给你一年你未必能克隆出来。
把你实验的信息多写点上来，不然没法帮你。

我用primer 3 input 在线设计了两对引物，用PCR扩后条带如图，不是预期的大小能帮我指点下是怎么回事么？我引物预期的片段大小4800左右，谢谢啦
克隆5KB左右的基因，两个多月了还没进展，求帮忙啊！！！！
2014-05-14_Sx col-0(1)_8bit.png
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9楼2014-05-15 14:55:07
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-13 17:31:27
没进展是什么个情况，能说仔细点么?

设计了几对引物都没扩出来，后来用的primer 3 input在线设计了两对引物，扩出来的片段却不预期的大
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10楼2014-05-15 14:57:23
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