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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆5KB左右的基因，两个多月了还没进展，求帮忙啊！！！！
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-13 18:00:02
基因够大的，你现在都做了哪几种方法做不出来啊？

其实我一直就觉得是我引物设计的问题，扩出来的片段大于预期的片段
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11楼2014-05-15 14:58:46
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:12:03
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:04
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

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12楼2014-05-15 15:06:42
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jimewosen

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by DavinciTesla at 2014-05-13 18:31:25
体液配方没弄好吧！

什么实验，要用体液

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13楼2014-05-15 15:08:11
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:17
引用回帖:
12楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-15 15:06:42
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

额，新手，不太会使用介个，见谅哈~
引物是上游：ctaaacgcgtaccggtcaat
         下游    ttctggcagcttttgtttcc
         模版：拟南芥基因组DNA
         酶：KOD -PLUS-NEO
        程序predenature:94度  2分钟
              denature:     98度  10秒
              annealing:     59度  30秒
             extension:      68度 2分30秒
            30个循环
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14楼2014-05-15 15:14:39
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zhangtao0502

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
米粒儿308(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-15 16:04:35
你用的酶的极限延伸能力有多大？反应的延伸时间是不是够长。

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15楼2014-05-15 15:16:59
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米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangtao0502 at 2014-05-15 15:16:59
你用的酶的极限延伸能力有多大？反应的延伸时间是不是够长。

极限好像十几kb，延伸时间是30s/kb，我用3分30秒扩出来的结果和2分30秒扩出来的差不多。。。
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16楼2014-05-15 15:19:32
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 米粒儿308 at 2014-05-15 15:14:39
额，新手，不太会使用介个，见谅哈~
引物是上游：ctaaacgcgtaccggtcaat
         下游    ttctggcagcttttgtttcc
         模版：拟南芥基因组DNA
         酶：KOD -PLUS-NEO
        程序predenature:94度   ...

你用primer-blast算下，TM是多少，然后找个便宜的mix扩下，退火时间长点，半分钟一分钟都可以的，扩增速度以一分钟一kb算

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17楼2014-05-15 19:54:43
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:12:37
建议：
1.退火温度太高，建议55度。
2.延伸时间太短，建议5-6分钟。
3.以上改进后还不行就重新设计引物。
4.直接从ABRC订购BAC克隆，可以在TAIR上查到，用BAC克隆的质粒做模板肯定可以扩出来。
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18楼2014-05-15 21:37:13
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把你的PCR产物测个序，看看你PCR到底问题出在哪里
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19楼2014-05-16 13:32:29
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白话八股

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物退火温度可能差的太多，或者温度不合适，你去算一下。如果序列不对，延伸温度增加下。还有你的dNTP

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最爱的那个人会出现在身边。
20楼2014-05-16 14:04:58
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