应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆5KB左右的基因，两个多月了还没进展，求帮忙啊！！！！
222/3返回列表上一页123下一页
查看: 2306  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-05-13 18:00:02
基因够大的，你现在都做了哪几种方法做不出来啊？

其实我一直就觉得是我引物设计的问题，扩出来的片段大于预期的片段
赞一下 回复此楼
11楼2014-05-15 14:58:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:12:03
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:04
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
12楼2014-05-15 15:06:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jimewosen

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by DavinciTesla at 2014-05-13 18:31:25
体液配方没弄好吧！

什么实验，要用体液

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
13楼2014-05-15 15:08:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2014-05-16 13:12:17
引用回帖:
12楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-15 15:06:42
你绕了那么远，还是没说到实验细节上，一个劲的说整不出来，有意义吗？你用什么酶，程序，引物都没交代，我真帮不了你

额，新手，不太会使用介个，见谅哈~
引物是上游：ctaaacgcgtaccggtcaat
         下游    ttctggcagcttttgtttcc
         模版：拟南芥基因组DNA
         酶：KOD -PLUS-NEO
        程序predenature:94度  2分钟
              denature:     98度  10秒
              annealing:     59度  30秒
             extension:      68度 2分30秒
            30个循环
赞一下 回复此楼
14楼2014-05-15 15:14:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangtao0502

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
米粒儿308(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-15 16:04:35
你用的酶的极限延伸能力有多大？反应的延伸时间是不是够长。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
15楼2014-05-15 15:16:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

米粒儿308

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by zhangtao0502 at 2014-05-15 15:16:59
你用的酶的极限延伸能力有多大？反应的延伸时间是不是够长。

极限好像十几kb，延伸时间是30s/kb，我用3分30秒扩出来的结果和2分30秒扩出来的差不多。。。
赞一下 回复此楼
16楼2014-05-15 15:19:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 米粒儿308 at 2014-05-15 15:14:39
额，新手，不太会使用介个，见谅哈~
引物是上游：ctaaacgcgtaccggtcaat
         下游    ttctggcagcttttgtttcc
         模版：拟南芥基因组DNA
         酶：KOD -PLUS-NEO
        程序predenature:94度   ...

你用primer-blast算下，TM是多少，然后找个便宜的mix扩下，退火时间长点，半分钟一分钟都可以的，扩增速度以一分钟一kb算

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
17楼2014-05-15 19:54:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-16 13:12:37
建议：
1.退火温度太高，建议55度。
2.延伸时间太短，建议5-6分钟。
3.以上改进后还不行就重新设计引物。
4.直接从ABRC订购BAC克隆，可以在TAIR上查到，用BAC克隆的质粒做模板肯定可以扩出来。
赞一下 回复此楼
18楼2014-05-15 21:37:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把你的PCR产物测个序，看看你PCR到底问题出在哪里
赞一下 回复此楼
19楼2014-05-16 13:32:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

白话八股

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物退火温度可能差的太多，或者温度不合适，你去算一下。如果序列不对，延伸温度增加下。还有你的dNTP

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
最爱的那个人会出现在身边。
20楼2014-05-16 14:04:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 米粒儿308 的主题更新
222/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 5/250 2026-09-29 09:52 by JzYBbHIXWSrW
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-29 09:49 by JzYBbHIXWSrW
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-29 09:24 by JzYBbHIXWSrW
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-29 09:18 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:34 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:18 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:12 by b8fCuTHqckEt
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[找工作] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:32 by ez6fGg9abYaj
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:28 by ez6fGg9abYaj
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-28 22:21 by ez6fGg9abYaj
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-28 19:08 by 9lS3ad5oOymn
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 18:51 by 9lS3ad5oOymn
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +7 zju2000 2026-09-26 8/400 2026-09-28 16:42 by beefly
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭