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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因，总是少28bp
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-27 14:17:20
这个问题无解，原因就是里面有个repeat,感觉当有两个repeat的时候，做PCR会跳过一个似的，不知道什么原因
这个问题我也遇到过，我克隆SV40的启动子，SV40启动子里面有个增强子，两个72bp的重复，做PCR，就是只能获 ...

最后也没扩增出来吗，你是72还是3的倍数，可能最后影响不会大，但是我的是28，不是3的倍数，不能继续往下做啊，哎，想听听你的想法

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11楼2014-05-28 00:11:48
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-27 16:13:24
你有可能遇到重复序列之类的问题了，引物设计长点，试试

长点也长不到重复序列那啊，会有帮助吗？

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12楼2014-05-28 00:12:47
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gyesang

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11楼: Originally posted by 一桶稀泥 at 2014-05-28 00:11:48
最后也没扩增出来吗，你是72还是3的倍数，可能最后影响不会大，但是我的是28，不是3的倍数，不能继续往下做啊，哎，想听听你的想法
...

你这个片段也不长，实在不行，去合成这个片段
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13楼2014-05-28 01:44:29
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-28 01:44:29
你这个片段也不长，实在不行，去合成这个片段...

我要做功能验证合成也行吗？

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14楼2014-05-28 07:53:26
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
一桶稀泥(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-29 13:10:25
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9楼: Originally posted by 一桶稀泥 at 2014-05-28 00:04:59
不是同一材料呢，怎么看是否是单考贝呢，我将原序列在乎ncni中比对，选择黄瓜基因组对吗？
...

如果从不同品种来源的基因组，那很可能存在等位变异，因此可以从不同品种或不同基因型的黄瓜中克隆你的目的基因。
是否单拷贝可以如你所说的做，既然黄瓜基因组都测序完成，那这个基因应该很好查到定位的。也可以参考其它物种这个基因的相关研究。（拿到基因一般都要在NCBI里搜索一番，看看相关序列，然后做个系统分析，预测一下基因功能啥的。）
你的基因如果编码区真缺失了28bp，除非是不编码蛋白的基因，或者在内含子区，否则就是个假基因了吧。
如果重复PCR都缺失28bp，那就不是PCR问题了。
都不知道你的模板是基因组还是cDNA，如果cDNA就不存在内含子的因素了。
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15楼2014-05-28 12:49:18
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一桶稀泥

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15楼: Originally posted by 白菜吃虫 at 2014-05-28 12:49:18
如果从不同品种来源的基因组，那很可能存在等位变异，因此可以从不同品种或不同基因型的黄瓜中克隆你的目的基因。
是否单拷贝可以如你所说的做，既然黄瓜基因组都测序完成，那这个基因应该很好查到定位的。也可以 ...

你的回答了，首先我的模板是CDNA， 另外我昨天用5个不同基因型的瓜重新PCR，用3%的胶去跑的，这回就能够看出条带在500以下了，一会我附上附图，除了我的模板以外，其他基因型的也都是同样的位置，所以我PCR的时候就少了28bp; 另外我这个基因没有内含子，很短，你看我该怎么办呢，我是想用功能验证呢，可以分段设计引物吗？
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16楼2014-05-28 13:05:03
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smdsfy

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR扩增用的是是什么酶？
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17楼2014-05-28 15:24:39
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
一桶稀泥(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-29 13:10:40
引用回帖:
14楼: Originally posted by 一桶稀泥 at 2014-05-28 07:53:26
我要做功能验证合成也行吗？
...

感觉你是想克隆这个基因做表达用的，你这个基因528bp不长，获得该基因除了从以cDNA为模板进行PCR扩增外，也可以去进行全基因合成

鉴于你这个问题，如果你实在是想通过自己分子克隆方法来解决这个重复序列PCR丢失问题也是可以的，不过比较复杂(不推荐这么做，技术上是可行的)，你可以从重复片段处分为上下两段，通过引入IIs限制性内切酶,如BsaI,BbsI等，分别回收PCR克隆前后两个片段，然后再通过限制性酶切将两个片段连接在一起。
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2014-05-28 17:49:26
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by smdsfy at 2014-05-28 15:24:39
PCR扩增用的是是什么酶？

tag酶，但不是高保真的
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19楼2014-05-28 18:09:20
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一桶稀泥

木虫 (正式写手)
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18楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-28 17:49:26
感觉你是想克隆这个基因做表达用的，你这个基因528bp不长，获得该基因除了从以cDNA为模板进行PCR扩增外，也可以去进行全基因合成

鉴于你这个问题，如果你实在是想通过自己分子克隆方法来解决这个重复序列PCR丢失 ...

你好，全基因合成以后可以转基因吧哈哈
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20楼2014-05-28 18:10:42
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