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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建，挑单菌落验证总是假阳性，求分析原因？！
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匿名

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1楼 2014-05-12 14:40:16
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匿名

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9楼2014-05-12 21:10:43
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-12 15:04:32
louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-05-12 20:52:44
多长时间菌长到可见?
一般来说的话是空质粒转进去了。也就是质粒酶切不干净，t载体就是质粒自连。重新双酶切或者逐个单酶切。重新连接转化

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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操蛋的XX
2楼2014-05-12 14:46:04
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gyesang

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【答案】应助回帖

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louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-05-12 20:57:47
“自己将kozak序列、信号肽（后加了一个酶切位点）连到空载体中构建成带有信号肽的载体，但是此时对载体进行双酶切时酶切效率很低，总有许多切不开”
这里你具体用的是什么限制性内切酶呢？你在信号肽后面加的一个酶切位点，具体是什么位点呢？
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3楼2014-05-12 15:07:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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louis_cheung: 金币+8, ★有帮助 2014-05-12 20:59:35
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-05-31 16:30:50
LZ的实验是先将kozak序列、信号肽序列PCR出来，酶切酶连到空载上，然后PCR基因，再酶切酶连到有kozak序列、信号肽序列的载体上。出现的问题是构建好的kozak序列、信号肽序列的载体切不开，与基因连不上，还有与基因连接后筛选平板上的转化子是假阳性，甚至没有转化子吗？还是说你筛选平板上长的有菌，但是菌连空载质粒也没有？
    问题首先可能出在你构建载体的酶切位点上，切割效率不高后期自然连接效果就很差，你添加的酶切位点是哪个位点？你的另一个位点是不是与你这个位点间隔很近？你的切割位点是不是收到甲基化影响？LZ可以双切载体不加基因做一次转化看看筛选平板上是不是长很多转化子，如果很多转化子的话那酶切就有问题。
    如果是菌连质粒都没有的话，那可能是你转化过程中染菌了，或者筛选平板抗生素失效了。
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大家相互帮助哈
4楼2014-05-12 15:47:21
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-05-12 21:10:57
双酶切用的什么酶切位点？而且你说连信号肽序列等，是否验证已连入且无突变？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2014-05-12 20:24:51
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匿名

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6楼2014-05-12 20:57:12
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匿名

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7楼2014-05-12 20:58:58
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-05-13 20:31:47
louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-05-13 20:41:26
引用回帖:
7楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 20:58:58
信号肽后加的是EcoR 1，双酶切用的是EcoR 1，Xba 1...

看看你加的XbaI位点是否处在甲基化序列当中，估计问题出在这里
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8楼2014-05-12 21:04:07
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