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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建，挑单菌落验证总是假阳性，求分析原因？！
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
louis_cheung(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:12:40
我构建的第一个重组质粒就是用的EcoRI和XbaI，Takara的，EcoRI：XbaI：0.1%BSA：10倍M buffer：模板为1:1:1:2:15
37度切割3个小时回收用于连接，切割不要超过3h，EcoRI在10倍M buffer里容易出现star活性。
EcoRI识别序列中存在GAATTCG时，易受到GC甲基化影响。
XbaI识别位点的序列为TCTAGATC 时，受dam methylase影响。此时，一般来源于E.coli的DNA很难被切断。
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大家相互帮助哈
21楼2014-05-13 21:32:43
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追随自由的心

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
louis_cheung(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:13:08
LZ是做了两次克隆，在第一次克隆时，Kozak序列和信号肽连接到载体后，有没有做测序分析，确保这段序列正确无误插入到载体正确的位置？第二个问题是，EcoR 1，Xba 1双酶位点是用来引入目的片段的？你用构建好的质粒切胶回收了4600bp的大小条带，也有可能是空载体本身，所以导致后期有阴性菌落。第三个问题，再确认一下，你第一次克隆和第二次克隆分别用的什么双酶切位点，便于分析问题。
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快乐也是一种能力
22楼2014-05-13 21:33:31
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906394648

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-13 20:45:55
EcoR 1和Xba 1用的是takara的，buffer 是其双酶切buffer表格里推荐的~...

Takara的这两个酶用的是不同的buffer，一个是高盐一个是低盐的，你自己看一下。我试过一个酶切、胶回收再酶切第二个，不过效果不好，还是不行，所以我建议你先重设引物，等引物要好几天，你再试试单酶切再单酶切
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23楼2014-05-14 09:51:00
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-14 22:13:36
酶切位点什么时候都要加到最外面，你加是到信号肽后面，有啥意义啊。把信号胎和kozak序列都切掉了。

[ 发自小木虫客户端 ]
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24楼2014-05-14 10:05:34
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
louis_cheung: 金币+3, ★有帮助 2014-06-07 15:50:42
引用回帖:
18楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-13 20:41:10
估计问题出在甲基化上，但是如何知道加的XbaI位点是否处在甲基化序列当中呢？请多多指教~...

最好把你设计的序列发上来，这样才好帮你具体分析，就一个做不出来，做不出来的可能原因多了去了

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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25楼2014-05-14 15:30:00
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匿名

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26楼2014-06-07 15:50:30
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gyesang

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引用回帖:
26楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-06-07 15:50:30
换了一种去甲基化酶的克隆宿主菌，问题解决了~...

问题还是出在甲基化上了，不知道你用的是什么去甲基化菌株？
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27楼2014-06-07 18:56:24
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匿名

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28楼2014-06-08 01:29:29
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发烧的昆虫

新虫 (初入文坛)
试试 promega的 T4 很好用的
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29楼2014-06-09 20:23:46
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匿名

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30楼2014-06-09 22:04:31
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