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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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louis_cheung: 金币+8, 有帮助 2014-05-12 20:59:35
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-05-31 16:30:50
LZ的实验是先将kozak序列、信号肽序列PCR出来,酶切酶连到空载上,然后PCR基因,再酶切酶连到有kozak序列、信号肽序列的载体上。出现的问题是构建好的kozak序列、信号肽序列的载体切不开,与基因连不上,还有与基因连接后筛选平板上的转化子是假阳性,甚至没有转化子吗?还是说你筛选平板上长的有菌,但是菌连空载质粒也没有?
    问题首先可能出在你构建载体的酶切位点上,切割效率不高后期自然连接效果就很差,你添加的酶切位点是哪个位点?你的另一个位点是不是与你这个位点间隔很近?你的切割位点是不是收到甲基化影响?LZ可以双切载体不加基因做一次转化看看筛选平板上是不是长很多转化子,如果很多转化子的话那酶切就有问题。
    如果是菌连质粒都没有的话,那可能是你转化过程中染菌了,或者筛选平板抗生素失效了。
大家相互帮助哈
4楼2014-05-12 15:47:21
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:10:43
筛选平板上长的有菌,菌中有空载体,没目的片段。
酶切位点为EcoR 1和Xba 1,酶切效率切目的片段还挺高的,但是切空载体时却挺低的,两酶切位点相距1400bp,相互影响应该不是很大,怀疑过甲基化影响,但不确定。但 ...

长出菌的空载体大小多大?线性长度是4600?还是6000?
大家相互帮助哈
11楼2014-05-12 21:22:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:47:05
谢谢提醒,这个真的不知道,过两天我去检测看看~...

如果是6000的,那就说明你酶切后回收混入了原有的空载质粒,只要混入质粒自然假阳性就高了。如果是4600的,那就说明你双酶切后的质粒自连了,或者切割位置不对。
大家相互帮助哈
15楼2014-05-12 22:23:38
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
louis_cheung(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励热心回帖交流 2014-05-14 09:12:40
我构建的第一个重组质粒就是用的EcoRI和XbaI,Takara的,EcoRI:XbaI:0.1%BSA:10倍M buffer:模板为1:1:1:2:15
37度切割3个小时回收用于连接,切割不要超过3h,EcoRI在10倍M buffer里容易出现star活性。
EcoRI识别序列中存在GAATTCG时,易受到GC甲基化影响。
XbaI识别位点的序列为TCTAGATC 时,受dam methylase影响。此时,一般来源于E.coli的DNA很难被切断。
大家相互帮助哈
21楼2014-05-13 21:32:43
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