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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:10:43
筛选平板上长的有菌,菌中有空载体,没目的片段。
酶切位点为EcoR 1和Xba 1,酶切效率切目的片段还挺高的,但是切空载体时却挺低的,两酶切位点相距1400bp,相互影响应该不是很大,怀疑过甲基化影响,但不确定。但 ...

长出菌的空载体大小多大?线性长度是4600?还是6000?
大家相互帮助哈
11楼2014-05-12 21:22:38
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★ ★
louis_cheung: 金币+3 2014-05-13 20:42:48
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-14 22:12:55
不知道你再次连接的自连是4600还是6000?如果前者,可能酶切出现星号活性导致;后者的话可能是你回收4600片段不纯。如果没有更好的办法,可以将两个酶切分步酶切回收,也许效果会好。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
12楼2014-05-12 21:33:21
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匿名

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13楼2014-05-12 21:47:05
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14楼2014-05-12 21:47:19
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:47:05
谢谢提醒,这个真的不知道,过两天我去检测看看~...

如果是6000的,那就说明你酶切后回收混入了原有的空载质粒,只要混入质粒自然假阳性就高了。如果是4600的,那就说明你双酶切后的质粒自连了,或者切割位置不对。
大家相互帮助哈
15楼2014-05-12 22:23:38
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shiqili471

金虫 (小有名气)

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★ ★
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louis_cheung: 金币+2, 有帮助 2014-05-13 20:43:11
双酶切效率不高的话,应该胶回收了吧,双酶切不应该自连啊
16楼2014-05-12 22:55:51
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906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
louis_cheung: 金币+4, 有帮助 2014-05-13 20:43:26
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-14 22:13:11
EcoR 1和Xba 1在原理上做酶切反应是用不同的buffer,但THERMO公司的快切酶的buffer是通用的,其他公司的不是通用的,你可以看看你的。
我之前也有过这种现象,我和我实验室的同学一起用的这两个酶,他可以切开我切不开,虽然我不知道实质的原因是什么,但是我觉的是跟你本身的基因和引物有关,我后来换了酶切位点,重新设置了引物就没有这个问题了。
17楼2014-05-13 19:24:29
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匿名

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18楼2014-05-13 20:41:10
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19楼2014-05-13 20:42:29
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20楼2014-05-13 20:45:55
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