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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建，挑单菌落验证总是假阳性，求分析原因？！
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:10:43
筛选平板上长的有菌，菌中有空载体，没目的片段。
酶切位点为EcoR 1和Xba 1，酶切效率切目的片段还挺高的，但是切空载体时却挺低的，两酶切位点相距1400bp，相互影响应该不是很大，怀疑过甲基化影响，但不确定。但 ...

长出菌的空载体大小多大？线性长度是4600？还是6000？
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大家相互帮助哈
11楼2014-05-12 21:22:38
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
louis_cheung: 金币+3 2014-05-13 20:42:48
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-14 22:12:55
不知道你再次连接的自连是4600还是6000？如果前者，可能酶切出现星号活性导致；后者的话可能是你回收4600片段不纯。如果没有更好的办法，可以将两个酶切分步酶切回收，也许效果会好。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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12楼2014-05-12 21:33:21
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匿名

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13楼2014-05-12 21:47:05
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匿名

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14楼2014-05-12 21:47:19
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by louis_cheung at 2014-05-12 21:47:05
谢谢提醒，这个真的不知道，过两天我去检测看看~...

如果是6000的，那就说明你酶切后回收混入了原有的空载质粒，只要混入质粒自然假阳性就高了。如果是4600的，那就说明你双酶切后的质粒自连了，或者切割位置不对。
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大家相互帮助哈
15楼2014-05-12 22:23:38
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shiqili471

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
louis_cheung: 金币+2, ★有帮助 2014-05-13 20:43:11
双酶切效率不高的话，应该胶回收了吧，双酶切不应该自连啊
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16楼2014-05-12 22:55:51
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906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
louis_cheung: 金币+4, ★有帮助 2014-05-13 20:43:26
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-14 22:13:11
EcoR 1和Xba 1在原理上做酶切反应是用不同的buffer，但THERMO公司的快切酶的buffer是通用的，其他公司的不是通用的，你可以看看你的。
我之前也有过这种现象，我和我实验室的同学一起用的这两个酶，他可以切开我切不开，虽然我不知道实质的原因是什么，但是我觉的是跟你本身的基因和引物有关，我后来换了酶切位点，重新设置了引物就没有这个问题了。
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17楼2014-05-13 19:24:29
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匿名

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18楼2014-05-13 20:41:10
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匿名

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19楼2014-05-13 20:42:29
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20楼2014-05-13 20:45:55
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