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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 质粒转化完后怎么做
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rongren

木虫 (小有名气)

[求助] 质粒转化完后怎么做

质粒转化完后该怎么做
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1楼 2012-05-31 09:29:05
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dshlove

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励回答 2012-05-31 21:13:35
转化之后摇2小时，就应该去涂平板了，涂完平板过夜之后，你该挑单菌落去做小剂量表达，顺便留菌种。小剂量表达的话就应该做大剂量了。最后收菌破碎，纯化。
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2楼2012-05-31 11:05:38
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37号童鞋

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+4, 鼓励 新人 2012-05-31 21:13:49
不知道楼主是做哪方面的
我们一般转化完质粒，大肠杆菌45min~1h37度220rpm
涂相应抗性的板
37度过夜
第二天挑单克隆
如果是要提蛋白
小摇过夜后大摇
我们用高压破碎菌液
收集蛋白并提纯
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3楼2012-05-31 11:13:08
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bingdong05

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+4, 鼓励交流 2012-05-31 21:13:58
那大肠杆菌来说：1）转化完毕后加入900微升的lb，37度，150rpm/min摇床1h左右，然后涂布相应抗生素平板，37度过夜，第二天看转化子生长情况；2）挑转化子到含有相应抗生素的lb液体培养基，37度过夜培养；3）提取质粒，做酶切或是pcr验证
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4楼2012-05-31 13:56:27
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励 2012-05-31 21:14:08
筛选阳性克隆，提取重组载体，通过转化、转导或者是转染受体菌
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5楼2012-05-31 19:03:27
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draco1987

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化，复苏，筛选平板培养，挑菌，菌液PCR验证，扩培。之后的步骤视用途而定。因为不知道具体的，只能大致给个步骤。楼上其实说的也都差不多，但是切记，挑菌后一定要鉴定阳性克隆（一般是做菌液PCR），筛选培养基只是初筛，有比较多的假阳性，不能完全信的。
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6楼2012-06-01 09:52:47
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jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化完一般就该摇菌了吧，应该啥大肠杆菌吧你的
我不知道你实验的目的，不过构建克隆一般都是下面步骤
①1mL的LB，37度，200rpm/min1h左右，然后涂布相应抗生素平板，37度过夜
②如果有克隆长出，挑转化子N个到含有相应抗生素的LB液体培养基，用小离心管，1mL，在37度培养3~4H
③液体PCR鉴定一下，如果是阳性，再转到5ml或更大体系去中摇，过夜后提取质粒，做酶切或是pcr验证
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7楼2012-06-01 13:51:16
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