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质粒转化
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最近做质粒转化实验总是不成功。我的具体方法是： 1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。 2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。 3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。 4. 加入0.9ml LB液体（提前37℃预热），于37℃恒温摇床上200rpm×50min 温育。 5. 将菌液5000rpm/min 离心5min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当 抗生素的琼脂平板表面（已提前涂布好抗生素，并预热），平板于37℃倒置培养过夜。 我的质粒（别人赠送）是PET-28a，质粒基因上有EcoRI及NheI酶切位点。但我的实验用不到酶切位点，只是要用里面的基因，所以我就没管酶切位点。再就是抗生素，因为PET-28a是卡那霉素抗性。我就先配成10mg/mL母液，置于-20℃保存。使用时再稀释成50ug/mL的工作液浓度。由于技术水平有限，我是将平板准备好后，在上面涂80uL的抗生素（50ug/mL）。 以上就是我的实验流程。但是我转了几次，只有第一次出现单菌落，其余几次都没有单菌落。在没有出现单菌落的情况下，我想试试是不是有菌产生，就把菌挑到LB液体中培养，但没有培养成功。 恳请各位高手指教！ |
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