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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒转化
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RQYLICHEE

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒转化

最近做质粒转化实验总是不成功。我的具体方法是：

1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。
3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。
4. 加入0.9ml LB液体（提前37℃预热），于37℃恒温摇床上200rpm×50min 温育。
5. 将菌液5000rpm/min 离心5min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当
抗生素的琼脂平板表面（已提前涂布好抗生素，并预热），平板于37℃倒置培养过夜。

我的质粒（别人赠送）是PET-28a，质粒基因上有EcoRI及NheI酶切位点。但我的实验用不到酶切位点，只是要用里面的基因，所以我就没管酶切位点。再就是抗生素，因为PET-28a是卡那霉素抗性。我就先配成10mg/mL母液，置于-20℃保存。使用时再稀释成50ug/mL的工作液浓度。由于技术水平有限，我是将平板准备好后，在上面涂80uL的抗生素（50ug/mL）。

   以上就是我的实验流程。但是我转了几次，只有第一次出现单菌落，其余几次都没有单菌落。在没有出现单菌落的情况下，我想试试是不是有菌产生，就把菌挑到LB液体中培养，但没有培养成功。

   恳请各位高手指教！
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1楼 2011-06-15 13:14:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-15 19:35:28
你这个情况有两个地方是有问题的，但是别担心，谁不是从不会到会的。
首先，转化方法没有问题，但是你最后离心用的5000rpm，个人感觉有点偏高，可以降至2500rpm，1min。
其次，你的板。为什么说自己技术水平有限呢，别人能做到的，你也一定能。如果你坚持不相信自己，请把你的抗生素稀释10倍。
好运。
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2楼2011-06-15 13:29:48
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普通回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

在上面涂80uL的抗生素，浓度就不是50ug/mL，浓度太高了菌没法长的！
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3楼2011-06-15 13:31:12
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-15 19:33:44
怎么做个质粒转化涂布这么麻烦；
直接将2ul质粒质粒转化进60-70ul感受态细胞中（电转）；然后用SOC培养基吹吸菌液，然后将菌液转移至1.5ml离心管中，摇床中摇1h，取出后取100-150ul菌液涂布在相应抗生素的板子上就可以。。。
第二天，一般18--24h挑板子上的单克隆进行验证就可以了。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-15 15:44:31
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gumingzhu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-15 21:51:20
我觉得需要考虑一下感受态问题，是不是感受态失效，另外，个人觉得离心时间过长，考虑一下
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改掉一个旧习惯有多难？？？？
5楼2011-06-15 16:58:29
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xuexue1204

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流 2011-06-15 21:51:31
我做时没有离心这步，直接就涂板，效果也挺好 的
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共同学习，共同进步，共同提高，加油！
6楼2011-06-15 18:13:19
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): good 2011-06-15 21:46:05
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-15 13:31:12:
在上面涂80uL的抗生素，浓度就不是50ug/mL，浓度太高了菌没法长的！

这样的抗生素浓度太高了。建议还是等灭菌后的三角瓶冷却到60℃（放在60℃的烘箱里）再加抗生素，加完摇匀倒平板。
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7楼2011-06-15 19:54:51
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

RQYLICHEE(金币+1): 2011-06-16 19:16:08
引用回帖:
Originally posted by RQYLICHEE at 2011-06-15 13:14:15:
最近做质粒转化实验总是不成功。我的具体方法是：

1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。
3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。
4. 加 ...

我把我以前做的转化步骤给你参考下，一般都会成功的~

(1) 将10μL连接液移入含200μL感受态细胞的1.5mL dorf管中，冰浴30-60min。y一般是45min
(2) 42℃水浴热激90sec后，立即再冰浴5min。
(3) 加入300μL LB液体培养基，37℃ 220 rpm培养1-2h。一般是2小时
(4)吸100μL菌液涂布含Amp（1ulAmp/ml培养基）平板培养基的LB固体培养基平板， 37℃ 培养16－24h。
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8楼2011-06-15 23:18:10
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ty1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以增大质粒的量到2ul，另外可能是Kan浓度较高，我们实验室采用的浓度一般是30ug/ml
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9楼2011-06-16 09:31:38
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

每板20uL的抗生素
最后离心1000rpm就好了
做阳性对照，看感受态有无问题
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
10楼2011-06-16 11:14:40
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