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RQYLICHEE

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒转化

最近做质粒转化实验总是不成功。我的具体方法是:

1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl 纯质粒,轻轻吹打混匀,冰浴30 min。
3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒,立即放入冰浴中2 min。
4. 加入0.9ml LB液体(提前37℃预热),于37℃恒温摇床上200rpm×50min 温育。
5. 将菌液5000rpm/min 离心5min,留200μl上清将菌体打散,均匀涂布于含适当
抗生素的琼脂平板表面(已提前涂布好抗生素,并预热),平板于37℃倒置培养过夜。

我的质粒(别人赠送)是PET-28a,质粒基因上有EcoRI及NheI酶切位点。但我的实验用不到酶切位点,只是要用里面的基因,所以我就没管酶切位点。再就是抗生素,因为PET-28a是卡那霉素抗性。我就先配成10mg/mL母液,置于-20℃保存。使用时再稀释成50ug/mL的工作液浓度。由于技术水平有限,我是将平板准备好后,在上面涂80uL的抗生素(50ug/mL)。

   以上就是我的实验流程。但是我转了几次,只有第一次出现单菌落,其余几次都没有单菌落。在没有出现单菌落的情况下,我想试试是不是有菌产生,就把菌挑到LB液体中培养,但没有培养成功。

   恳请各位高手指教!
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

在上面涂80uL的抗生素,浓度就不是50ug/mL,浓度太高了菌没法长的!
3楼2011-06-15 13:31:12
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-15 19:35:28
你这个情况有两个地方是有问题的,但是别担心,谁不是从不会到会的。
首先,转化方法没有问题,但是你最后离心用的5000rpm,个人感觉有点偏高,可以降至2500rpm,1min。
其次,你的板。为什么说自己技术水平有限呢,别人能做到的,你也一定能。如果你坚持不相信自己,请把你的抗生素稀释10倍。
好运。
2楼2011-06-15 13:29:48
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-15 19:33:44
怎么做个质粒转化涂布这么麻烦;
直接将2ul质粒质粒转化进60-70ul感受态细胞中(电转);然后用SOC培养基吹吸菌液,然后将菌液转移至1.5ml离心管中,摇床中摇1h,取出后取100-150ul菌液涂布在相应抗生素的板子上就可以。。。
第二天,一般18--24h挑板子上的单克隆进行验证就可以了。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-06-15 15:44:31
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gumingzhu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-15 21:51:20
我觉得需要考虑一下感受态问题,是不是感受态失效,另外,个人觉得离心时间过长,考虑一下
改掉一个旧习惯有多难????
5楼2011-06-15 16:58:29
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