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RQYLICHEE

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 88.5
帖子: 13
在线: 2.6小时
虫号: 1273205
注册: 2011-04-21
专业: 生物化学

[求助] 质粒转化

最近做质粒转化实验总是不成功。我的具体方法是：

1. 取100μl 感受态细胞于冰浴上融化。
2. 加入1μl 纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。
3. 将菌液放入42℃水浴中热激90 秒，立即放入冰浴中2 min。
4. 加入0.9ml LB液体（提前37℃预热），于37℃恒温摇床上200rpm×50min 温育。
5. 将菌液5000rpm/min 离心5min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当
抗生素的琼脂平板表面（已提前涂布好抗生素，并预热），平板于37℃倒置培养过夜。

我的质粒（别人赠送）是PET-28a，质粒基因上有EcoRI及NheI酶切位点。但我的实验用不到酶切位点，只是要用里面的基因，所以我就没管酶切位点。再就是抗生素，因为PET-28a是卡那霉素抗性。我就先配成10mg/mL母液，置于-20℃保存。使用时再稀释成50ug/mL的工作液浓度。由于技术水平有限，我是将平板准备好后，在上面涂80uL的抗生素（50ug/mL）。

以上就是我的实验流程。但是我转了几次，只有第一次出现单菌落，其余几次都没有单菌落。在没有出现单菌落的情况下，我想试试是不是有菌产生，就把菌挑到LB液体中培养，但没有培养成功。

恳请各位高手指教！

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