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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切总是切不开。。。
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带走云彩

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切总是切不开。。。已有2人参与

不知道是模板的酶切位点出问题了，还是酶有问题，总之很少能成功切开的，这次又这样，。。。如图，2为质粒，1为hindIII和Ecor V双酶切，可是，根本没有两条带，切开的话，一条1500，一条3500，质粒约5000，求解惑！！

双酶切总是切不开。。。
20140506 Ptrc+双酶切验证模板2.jpg
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怎知一死生为虚诞？
1楼2014-05-06 19:48:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
带走云彩(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-06 22:14:47
有时候质粒量太大也会导致酶切困难。从条带亮度看，楼主质粒的上样量都有几百ng了吧，可以把用量减少到1/10试试。
酶切时DNA不是越多越好，酶的说明书对用量都会有说明的，可以去对照说明书看看是不是真的过量了。
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2楼2014-05-06 21:00:03
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
带走云彩(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-05-06 22:14:57
带走云彩: 金币+1, ★有帮助 2014-05-07 09:25:09
1. 双酶切buffer是否合适？
2. 适当加大酶用量，延长酶切时间；
3. 还不行就分步酶切。。。
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-05-06 21:27:09
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
带走云彩: 金币+1 2014-05-07 09:27:34
HindIII和EcoRV酶切的buffer基本不通用，要么加酶量，要么延长时间，这个是必须的。
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4楼2014-05-07 03:41:18
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带走云彩

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2014-05-06 21:00:03
有时候质粒量太大也会导致酶切困难。从条带亮度看，楼主质粒的上样量都有几百ng了吧，可以把用量减少到1/10试试。
酶切时DNA不是越多越好，酶的说明书对用量都会有说明的，可以去对照说明书看看是不是真的过量了。

但是一单位的酶不都能切1ug的DNA么？而且量少的话总是怕条带不显啊。。。
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怎知一死生为虚诞？
5楼2014-05-07 09:24:47
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带走云彩

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by meng_xu at 2014-05-07 03:41:18
HindIII和EcoRV酶切的buffer基本不通用，要么加酶量，要么延长时间，这个是必须的。

都是promega的，选了相对活性都可以的muticore buffer
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怎知一死生为虚诞？
6楼2014-05-07 09:27:13
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