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由田120516

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】急！！！！酶切位点切不开

我设计一对引物PCR扩增一段基因，并将其连在T载体上。经PCR验证，没有问题，但酶切这段序列时却切不开。
引物：5‘-CTTAGATCTACCAATGCTTAATCAGTGAGG
       5’-CGGAGATCTGGAACCCCTATTTGTTTATTT
AGATCT为BglII酶切位点，就是要从T载体上用引物上的BglII酶切位点把这段序列切下来。
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1楼 2011-03-11 15:53:22
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-03-11 17:33:57
换用载体上的酶切位点再切切看。
另外，切的时候跑质粒对照了吗？是个什么情况？
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2楼2011-03-11 16:01:03
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-03-11 17:34:07
酶切不出来是什么情况，没有片段，多片段还是切不开质粒啊，另T载体是什么载体，最好把图片放上来，这样也好分析啊。你这样说，那只可能是你的内切酶挂了，借一支新的酶和新的buffer来切下看。
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3楼2011-03-11 16:01:47
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-03-11 17:34:17
沙发的办法是好办法，不管什么t载体，用载体上的酶切位点验证下
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4楼2011-03-11 16:02:45
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天使托

专家顾问 (职业作家)
你两条引物都是一个酶切位点。应该可以切开的，但是我怎么感觉你第二条引物有点问题啊，那么多T。
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5楼2011-03-11 17:56:02
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wangleisdnu

金虫 (正式写手)
it is better to sequence it, you are not sure if there is some problem in your primer
sometime the mistake is due to primer synthesis
also check your digestion buffer or incubation temperature
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6楼2011-03-11 20:09:06
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郝钊

金虫 (小有名气)
不知道你验证了几个转化子。
如果确定内切酶和酶切体系配置没有问题的话，可能是PCR产物有问题，酶切位点突变掉了。建议测序验证一下。
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7楼2011-03-11 20:11:17
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zdq516122164

新虫 (小有名气)
看看你的酶  过期没
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8楼2011-03-11 21:12:46
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
测个序就知道了啊
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9楼2011-03-11 23:50:34
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