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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物测序结果差 求分析
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物测序结果差 求分析已有6人参与

各位大神：我之前做了个PCR，电泳结果如下图（条带从左到右依次是1、2、3、4），1、2是18S，约1kb，3、4是28S，约700bp，其中1、3是同一个DNA模板，2、4是同一个的。我看主带清晰也挺亮的，就直接送华大测序了，结果出来没有一个成功的，华大反馈的原因是：1：测序失败，峰图质量差，可信序列仅100bp；2：杂合，多位点规则套峰；3：重复序列，重复序列后峰图变乱；4：重复序列，重复序列后峰图变乱。
我想请问：1、PCR结果像我这样的，测序结果却全部失败，正常吗？会是什么原因？测序公司的问题还是我做的物种的基因问题？
                2、搞不清楚他所谓的“重复序列”是什么情况，有知道的大虾帮忙分析一下吧。
                3、像我这个情况做克隆后再测序管用吗？特别是“重复序列”的做克隆可以吗？
跪求高手指点，感激不尽！！

PCR产物测序结果差 求分析
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越努力越幸运
1楼2014-04-10 13:23:48
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-04-10 19:01:51
柠檬可乐星: 金币+3, ★有帮助 2014-04-10 20:21:57
看你的结果，PCR产物中有杂带，不适于直接测序。可以切胶回收后回收产物送测序，或者再保险点连接载体测序。
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2楼2014-04-10 16:11:03
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-10 20:21:27
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:26:53
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1，2的反馈的话，可以做到载体，挑单克隆然后送测应该可以完成。
3，4的反馈的话，关于重复序列，测序其实是挺难的，可以让华大的分析员人工读峰图。
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3楼2014-04-10 16:13:01
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-10 20:22:10
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-10 16:13:01
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1，2的反馈的话，可以做到载体，挑单克隆然后送测应该可以完成。
3，4的反馈的话，关于重复序列，测序其实是挺难的，可以让华大的分析员人工读 ...

分析的很到位，最好连载体，挑单克隆测序
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4楼2014-04-10 16:29:06
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-04-10 19:02:01
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-10 20:22:17
一看你那图就知道不能直接测序，杂带太多，切胶回收，克隆后测序会比较好

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2014-04-10 19:00:26
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-10 16:13:01
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1，2的反馈的话，可以做到载体，挑单克隆然后送测应该可以完成。
3，4的反馈的话，关于重复序列，测序其实是挺难的，可以让华大的分析员人工读 ...

那么3、4即使做克隆也不一定能测出来吗？
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越努力越幸运
6楼2014-04-10 20:10:41
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-10 19:00:26
一看你那图就知道不能直接测序，杂带太多，切胶回收，克隆后测序会比较好

我是看实验室其他人做的 有的条带还不如我这 测序都没问题的 所以就想直接测下试试
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7楼2014-04-10 20:11:45
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-04-10 16:11:03
看你的结果，PCR产物中有杂带，不适于直接测序。可以切胶回收后回收产物送测序，或者再保险点连接载体测序。

嗯，谢谢啦，接下来是准备克隆的
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越努力越幸运
8楼2014-04-10 20:13:25
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
还有就是，如果我当时让测序公司切胶后测序，各位大神觉得结果会怎么样呢？能测出来吗？
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越努力越幸运
9楼2014-04-10 20:21:05
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ningxia217

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-10 20:21:05
还有就是，如果我当时让测序公司切胶后测序，各位大神觉得结果会怎么样呢？能测出来吗？

切胶回收后要好一些，如果你的目的条带纯化效果较好，不会出现多个杂合套峰的情况。
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10楼2014-04-10 22:21:25
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