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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物测序结果差 求分析 已有6人参与

各位大神:我之前做了个PCR,电泳结果如下图(条带从左到右依次是1、2、3、4),1、2是18S,约1kb,3、4是28S,约700bp,其中1、3是同一个DNA模板,2、4是同一个的。我看主带清晰也挺亮的,就直接送华大测序了,结果出来没有一个成功的,华大反馈的原因是:1:测序失败,峰图质量差,可信序列仅100bp;2:杂合,多位点规则套峰;3:重复序列,重复序列后峰图变乱;4:重复序列,重复序列后峰图变乱。
我想请问:1、PCR结果像我这样的,测序结果却全部失败,正常吗?会是什么原因?测序公司的问题还是我做的物种的基因问题?
                2、搞不清楚他所谓的“重复序列”是什么情况,有知道的大虾帮忙分析一下吧。
                3、像我这个情况做克隆后再测序管用吗?特别是“重复序列”的做克隆可以吗?
跪求高手指点,感激不尽!!

PCR产物测序结果差 求分析
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-10 19:01:51
柠檬可乐星: 金币+3, 有帮助 2014-04-10 20:21:57
看你的结果,PCR产物中有杂带,不适于直接测序。可以切胶回收后回收产物送测序,或者再保险点连接载体测序。
2楼2014-04-10 16:11:03
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-04-10 20:21:27
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-13 18:26:53
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1,2的反馈的话,可以做到载体,挑单克隆然后送测应该可以完成。
3,4的反馈的话,关于重复序列,测序其实是挺难的,可以让华大的分析员人工读峰图。
3楼2014-04-10 16:13:01
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-10 20:22:10
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-10 16:13:01
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1,2的反馈的话,可以做到载体,挑单克隆然后送测应该可以完成。
3,4的反馈的话,关于重复序列,测序其实是挺难的,可以让华大的分析员人工读 ...

分析的很到位,最好连载体,挑单克隆测序
4楼2014-04-10 16:29:06
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
柠檬可乐星(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-04-10 19:02:01
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-10 20:22:17
一看你那图就知道不能直接测序,杂带太多,切胶回收,克隆后测序会比较好

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-04-10 19:00:26
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-04-10 16:13:01
PCR产物直接送测的话有时候因为专一性的问题是可能出现这种现象的。
1,2的反馈的话,可以做到载体,挑单克隆然后送测应该可以完成。
3,4的反馈的话,关于重复序列,测序其实是挺难的,可以让华大的分析员人工读 ...

那么3、4即使做克隆也不一定能测出来吗?
越努力越幸运
6楼2014-04-10 20:10:41
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-10 19:00:26
一看你那图就知道不能直接测序,杂带太多,切胶回收,克隆后测序会比较好

我是看实验室其他人做的 有的条带还不如我这 测序都没问题的 所以就想直接测下试试
越努力越幸运
7楼2014-04-10 20:11:45
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-04-10 16:11:03
看你的结果,PCR产物中有杂带,不适于直接测序。可以切胶回收后回收产物送测序,或者再保险点连接载体测序。

嗯,谢谢啦,接下来是准备克隆的
越努力越幸运
8楼2014-04-10 20:13:25
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

还有就是,如果我当时让测序公司切胶后测序,各位大神觉得结果会怎么样呢?能测出来吗?
越努力越幸运
9楼2014-04-10 20:21:05
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ningxia217

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-10 20:21:05
还有就是,如果我当时让测序公司切胶后测序,各位大神觉得结果会怎么样呢?能测出来吗?

切胶回收后要好一些,如果你的目的条带纯化效果较好,不会出现多个杂合套峰的情况。
10楼2014-04-10 22:21:25
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