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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带不清晰
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谢伊莹

木虫 (正式写手)

[求助] PCR条带不清晰 已有6人参与

如题，如图，marker为 2000bp，两块胶中最亮的那个泳道就是marker，左胶共有三个泳道，与marker比，第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带，右图同样，marker和marker右侧的五个泳道有样品，第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带，条件：94 5min 94 10s 52 10s 72 1min30s 72 7min，体系：Mg2+ 0.7 dNTP 0.8 上下游引物 1 模板 1 buffer 1 ddH2O 4.3 Taq 0.2，求指教
PCR条带不清晰
p胶回收PCR-pP-1210P-1210J-1216P-1216J-14224.jpg
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1楼 2014-02-24 21:17:35
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wang6rrtoy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议变性94℃  45s，褪火55℃  45s，可能是你这两个步骤的时间太短了，所以DNA复制的很少。同时Nanodrop看下模板的质量，依本人经验而言，一般PCR体系模板的浓度控制在1ng为好！
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好好学习
8楼2014-02-25 19:15:51
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-25 15:16:32
1.查看模板来源，纯度、浓度是否够。
2.选择一个正对照，保证PCR系统没问题。
3. touch-down 或者二轮PCR，或许可以试试。
4. 可以考虑重新调整引物。
祝好！
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2楼2014-02-24 21:55:18
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的条带大小有没有搞错---52℃10s？有没有考虑到酶的延伸速度？
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学习使你立于不败之地
3楼2014-02-24 22:44:53
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谢伊莹

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-02-24 22:44:53
目的条带大小有没有搞错---52℃10s？有没有考虑到酶的延伸速度？

目的条带1400bp左右，有一篇相关文献的退火时间是10s，所以就一直用这个时间，这个温度了
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4楼2014-02-25 18:14:08
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