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lwzy888

金虫 (小有名气)

[求助] DGGE图模糊,没有特别亮的条带是什么原因

最近一直在做DGGE,每次图都有问题,这次的图比之前的稍微好点,可是还是条带模糊,请问各位是什么原因呢?
1.从左边数1-4是一种样品,只是上样量不同,有4管浓缩成的10μ,15μ,20μ的样,还有8管浓缩成的10μ的样。5-8也是同样的上样量。
   可以发现,不管加多少量,条带的亮度都是一样的。这很奇怪。
2.我是用的200V,4.5小时。
3.采用gel red染色,染色半小时。取1.5μ原液稀释10000倍,然后均匀滴到胶上。个人感觉也可能与这种方法染色不均匀有关。不知道是不是。
4.胶浓度是35%-55%。
5.染色后发现泳道弯曲,是不是因为夹板没有夹紧的原因呢?
DGGE图模糊,没有特别亮的条带是什么原因
Administrator 2013-11-02 19 时 49 分.jpg
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lwzy888

金虫 (小有名气)

另外,我的V3区之后又做了reconditioning PCR,拿V3区的产物5μ继续PCR,这样的4管或者8管进行浓缩成20μ左右,然后跑胶大致估计它的浓度,发现,每次跑的都是这样子条带弯曲。跑胶时上样量3μ,虽然条带很亮,但是条带弯曲搞不清楚是什么原因。
DGGE图模糊,没有特别亮的条带是什么原因-1
Administrator 2013-11-02 12 时 51 分.jpg

2楼2013-11-07 17:40:28
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开云者

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助! 2013-11-08 23:15:09
1:下图的条带弯曲可能是你电压太高,或者你没有凝胶好,让它多凝一会,把梳子也注意一些2:DGGE的你是不是点样点到带有加热棒的那一面了?不是的话,可能是一直用200V跑的原因,可以试试先200V跑10分钟,再150V6个小时
挥霍不起青春
3楼2013-11-07 21:10:40
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lwzy888

金虫 (小有名气)

谢谢你的回复!
1,电压我试过90伏和75伏的,凝胶时间也比较长,我都是凝完胶去做别的实验,一小时左右吧!还是不懂什么原因。其他的比如DNA的还有其他PCR的电泳我都跑的很好的,就这个让我很郁闷!
2,DGGE两面都是可以跑的,我没跑过带加热棒的那面,不过有人跑过两面的都没事。那下次我试试先200V后150V。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2013-11-07 22:19:56
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luobin506

禁虫 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

5楼2013-11-08 18:50:52
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laozuzunzhe

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lwzy888: 金币+10, 有帮助, 谢谢你的回答!让我知道了部分原因,DGGE条带模糊还是不知道原因。 2013-11-09 06:42:28
lwzy888: 金币+10, 有帮助, 谢谢你的回答!让我知道了部分原因,DGGE条带模糊还是不知道原因。 2013-11-09 06:42:34
我觉得下图条带弯曲变形可能是上样浓度太高。
泳道弯曲是胶的问题,而且一般会有边缘效应,浓度高的条带会对旁边低浓度条带产生影响。
6楼2013-11-08 23:12:39
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lwzy888

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by luobin506 at 2013-11-08 18:50:52
我觉得可以尝试把PCR产物做个胶回收!

如果胶回收的话,DGGE条带会亮吗?我总感觉胶回收还有PCR纯化会有损失,条带会少,会对结果不好。谢谢你的回答!非常感谢!
7楼2013-11-09 06:37:56
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lwzy888

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by laozuzunzhe at 2013-11-08 23:12:39
我觉得下图条带弯曲变形可能是上样浓度太高。
泳道弯曲是胶的问题,而且一般会有边缘效应,浓度高的条带会对旁边低浓度条带产生影响。

浓度高的原因使得条带变形我觉得很有可能。DGGE的胶看来我要好好再琢磨一下了,每次胶都不好。非常感谢!
8楼2013-11-09 06:46:21
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