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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » DGGE图模糊，没有特别亮的条带是什么原因
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lwzy888

金虫 (小有名气)

[求助] DGGE图模糊，没有特别亮的条带是什么原因

最近一直在做DGGE,每次图都有问题，这次的图比之前的稍微好点，可是还是条带模糊，请问各位是什么原因呢？
1.从左边数1-4是一种样品，只是上样量不同，有4管浓缩成的10μ，15μ，20μ的样，还有8管浓缩成的10μ的样。5-8也是同样的上样量。
   可以发现，不管加多少量，条带的亮度都是一样的。这很奇怪。
2.我是用的200V，4.5小时。
3.采用gel red染色，染色半小时。取1.5μ原液稀释10000倍，然后均匀滴到胶上。个人感觉也可能与这种方法染色不均匀有关。不知道是不是。
4.胶浓度是35%-55%。
5.染色后发现泳道弯曲，是不是因为夹板没有夹紧的原因呢？
DGGE图模糊，没有特别亮的条带是什么原因
Administrator 2013-11-02 19 时 49 分.jpg
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1楼 2013-11-07 17:10:09
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lwzy888

金虫 (小有名气)
另外，我的V3区之后又做了reconditioning PCR,拿V3区的产物5μ继续PCR,这样的4管或者8管进行浓缩成20μ左右，然后跑胶大致估计它的浓度，发现，每次跑的都是这样子条带弯曲。跑胶时上样量3μ，虽然条带很亮，但是条带弯曲搞不清楚是什么原因。
DGGE图模糊，没有特别亮的条带是什么原因-1
Administrator 2013-11-02 12 时 51 分.jpg
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2楼2013-11-07 17:40:28
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开云者

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-11-08 23:15:09
1：下图的条带弯曲可能是你电压太高，或者你没有凝胶好，让它多凝一会，把梳子也注意一些2：DGGE的你是不是点样点到带有加热棒的那一面了？不是的话，可能是一直用200V跑的原因，可以试试先200V跑10分钟，再150V6个小时
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挥霍不起青春
3楼2013-11-07 21:10:40
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lwzy888

金虫 (小有名气)
谢谢你的回复！
1，电压我试过90伏和75伏的，凝胶时间也比较长，我都是凝完胶去做别的实验，一小时左右吧！还是不懂什么原因。其他的比如DNA的还有其他PCR的电泳我都跑的很好的，就这个让我很郁闷！
2，DGGE两面都是可以跑的，我没跑过带加热棒的那面，不过有人跑过两面的都没事。那下次我试试先200V后150V。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-11-07 22:19:56
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luobin506

禁虫 (著名写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
5楼2013-11-08 18:50:52
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laozuzunzhe

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lwzy888: 金币+10, ★有帮助, 谢谢你的回答！让我知道了部分原因，DGGE条带模糊还是不知道原因。 2013-11-09 06:42:28
lwzy888: 金币+10, ★有帮助, 谢谢你的回答！让我知道了部分原因，DGGE条带模糊还是不知道原因。 2013-11-09 06:42:34
我觉得下图条带弯曲变形可能是上样浓度太高。
泳道弯曲是胶的问题，而且一般会有边缘效应，浓度高的条带会对旁边低浓度条带产生影响。
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6楼2013-11-08 23:12:39
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lwzy888

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luobin506 at 2013-11-08 18:50:52
我觉得可以尝试把PCR产物做个胶回收!

如果胶回收的话，DGGE条带会亮吗？我总感觉胶回收还有PCR纯化会有损失，条带会少，会对结果不好。谢谢你的回答！非常感谢！
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7楼2013-11-09 06:37:56
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lwzy888

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by laozuzunzhe at 2013-11-08 23:12:39
我觉得下图条带弯曲变形可能是上样浓度太高。
泳道弯曲是胶的问题，而且一般会有边缘效应，浓度高的条带会对旁边低浓度条带产生影响。

浓度高的原因使得条带变形我觉得很有可能。DGGE的胶看来我要好好再琢磨一下了，每次胶都不好。非常感谢！
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8楼2013-11-09 06:46:21
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