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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 植物gDNA为模板，PCR前几次出现清晰条带，后面出现涂抹型条带是什么原因？
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LYSH1103

新虫 (初入文坛)

[求助] 植物gDNA为模板，PCR前几次出现清晰条带，后面出现涂抹型条带是什么原因？ 已有5人参与

我是PCR后进行测序，第一副图是之前的PCR，第二份图是P不出来的图。最后的图片是DNA的质量。体系时50微升的。同KOD酶和普通Taq都是出现相同的现象。求各位指点。
植物gDNA为模板，PCR前几次出现清晰条带，后面出现涂抹型条带是什么原因？
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植物gDNA为模板，PCR前几次出现清晰条带，后面出现涂抹型条带是什么原因？-1
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植物gDNA为模板，PCR前几次出现清晰条带，后面出现涂抹型条带是什么原因？-2
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1楼 2014-01-08 23:12:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-09 08:51:59
LYSH1103: 金币+1, ★★★很有帮助, 我金币太少了，不够分啊，因为是新虫 。。吱吱 2014-01-14 09:46:48
可能是模板用量不正确。而且样品里含有RNA，可能影响引物与模板的结合。
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2楼2014-01-09 02:14:10
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梦若冰凌80

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
LYSH1103: 金币+1, 我的金币不够啦，，新虫穷啊。。。嘎嘎 2014-01-14 09:47:21
胶和电泳的问题，之前遇到过，一个是胶做的不合适，一个电泳仪设置的有问题，前者的可能性比较大
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4楼2014-01-09 10:39:21
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by LYSH1103 at 2014-01-09 08:07:43
我测了我稀释后DNA的浓度，是20-80ng不等。50微升用1微升。...

因为样品里有RNA和其它杂质，可能需要适当增加镁离子浓度或者降低退火温度。
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6楼2014-01-09 12:24:13
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ruikun

新虫 (初入文坛)
请问楼主问题解决了吗？我最近也出现了这样的问题，很需要指点啊!!
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7楼2014-01-09 16:57:28
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yuanbeauty

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
LYSH1103: 金币+1, ★★★很有帮助, 金币不够分啊。。新虫。。吱吱 2014-01-14 09:48:29
DNA电泳图是稀释后的吗？ 另外，前几次能P出来，后又P不出来，这几次用的是相同的DNA模板吗？

DNA浓度过高，会没有产物的。这是我们的经验，供参考。
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8楼2014-01-09 18:13:30
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普通回帖

LYSH1103

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-09 02:14:10
可能是模板用量不正确。而且样品里含有RNA，可能影响引物与模板的结合。

我测了我稀释后DNA的浓度，是20-80ng不等。50微升用1微升。
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3楼2014-01-09 08:07:43
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LYSH1103

新虫 (初入文坛)
这个现象持续20天了。我做1.0的胶，电泳仪大家都用一个，别人能跑出来啊！PCR仪我也换着用过了。还是一样。。。我就有点崩溃啊。。。
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5楼2014-01-09 11:37:07
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LYSH1103

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-09 12:24:13
因为样品里有RNA和其它杂质，可能需要适当增加镁离子浓度或者降低退火温度。...

我在提取DNA的时候已经用过RNase A .其他杂质这个就。。。难弄啦。。。。我用的是降落式PCR程序，55-65度，还要再低点吗？出现问题后我也试过45-55度和50-60度。酶有结果啊。镁离子这个我倒是没有提高。因为我觉得体系没有问题。之前很好啊。对了，我也怀疑过DNA质量，我也新提取了DNA，还是一个样子。。。
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9楼2014-01-11 20:42:08
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LYSH1103

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yuanbeauty at 2014-01-09 18:13:30
DNA电泳图是稀释后的吗？ 另外，前几次能P出来，后又P不出来，这几次用的是相同的DNA模板吗？

DNA浓度过高，会没有产物的。这是我们的经验，供参考。

DNA 的图是原样品的。是的用的相同的DNA ,后来又新提取了DNA，还是相同的效果。就 很崩溃。所以请教给位大神啊。。。
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10楼2014-01-11 20:44:40
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