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谢伊莹

木虫 (正式写手)

[求助] PCR条带不清晰 已有6人参与

如题,如图,marker为 2000bp,两块胶中最亮的那个泳道就是marker,左胶共有三个泳道,与marker比,第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带,右图同样,marker和marker右侧的五个泳道有样品,第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带,条件:94 5min 94 10s 52 10s 72 1min30s 72 7min,体系:Mg2+ 0.7 dNTP 0.8 上下游引物 1 模板 1 buffer 1 ddH2O 4.3 Taq 0.2,求指教
PCR条带不清晰
p胶回收PCR-pP-1210P-1210J-1216P-1216J-14224.jpg
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-25 15:16:32
1.查看模板来源,纯度、浓度是否够。
2.选择一个正对照,保证PCR系统没问题。
3. touch-down 或者二轮PCR,或许可以试试。
4. 可以考虑重新调整引物。
祝好!
2楼2014-02-24 21:55:18
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
目的条带大小有没有搞错---52℃10s?有没有考虑到酶的延伸速度?
学习使你立于不败之地
3楼2014-02-24 22:44:53
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谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-02-24 22:44:53
目的条带大小有没有搞错---52℃10s?有没有考虑到酶的延伸速度?

目的条带1400bp左右,有一篇相关文献的退火时间是10s,所以就一直用这个时间,这个温度了
4楼2014-02-25 18:14:08
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谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-24 21:55:18
1.查看模板来源,纯度、浓度是否够。
2.选择一个正对照,保证PCR系统没问题。
3. touch-down 或者二轮PCR,或许可以试试。
4. 可以考虑重新调整引物。
祝好!

1模板是新提的基因组,条带很清晰
2正对照是指?做一个16s PCR可以么
3我们PCR仪不支持touch down,直接拿PCR产物做模板进行二轮PCR?
4由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的
谢谢,期待进一步回复~
5楼2014-02-25 18:25:00
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mjt2007

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能引物特异性不太好,可以重新设计引物试一次。好运!
Theworldisnotinyourbooksandmaps,itisoutthere.
6楼2014-02-25 18:25:19
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yuren2009

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 18:14:08
目的条带1400bp左右,有一篇相关文献的退火时间是10s,所以就一直用这个时间,这个温度了...

你试试试延长到30s。文献上有些PCR程序别人拿过去不一定就是最佳的,只能作个参考;要么就是你的引物不好。
学习使你立于不败之地
7楼2014-02-25 19:03:16
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wang6rrtoy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议变性94℃  45s,褪火55℃  45s,可能是你这两个步骤的时间太短了,所以DNA复制的很少。同时Nanodrop看下模板的质量,依本人经验而言,一般PCR体系模板的浓度控制在1ng为好!
好好学习
8楼2014-02-25 19:15:51
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谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by mjt2007 at 2014-02-25 18:25:19
可能引物特异性不太好,可以重新设计引物试一次。好运!

由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的,谢谢您的回复~
9楼2014-02-25 20:03:25
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mjt2007

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 20:03:25
由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的,谢谢您的回复~...

没有基因序列建议先克隆出这个基因。好运!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
Theworldisnotinyourbooksandmaps,itisoutthere.
10楼2014-02-26 04:49:37
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