24小时热门版块排行榜    

查看: 4073  |  回复: 20

谢伊莹

木虫 (正式写手)

[求助] PCR条带不清晰 已有6人参与

如题,如图,marker为 2000bp,两块胶中最亮的那个泳道就是marker,左胶共有三个泳道,与marker比,第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带,右图同样,marker和marker右侧的五个泳道有样品,第一条带和第二条带之间的位置模糊不清的是目的条带,条件:94 5min 94 10s 52 10s 72 1min30s 72 7min,体系:Mg2+ 0.7 dNTP 0.8 上下游引物 1 模板 1 buffer 1 ddH2O 4.3 Taq 0.2,求指教
PCR条带不清晰
p胶回收PCR-pP-1210P-1210J-1216P-1216J-14224.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-25 15:16:32
1.查看模板来源,纯度、浓度是否够。
2.选择一个正对照,保证PCR系统没问题。
3. touch-down 或者二轮PCR,或许可以试试。
4. 可以考虑重新调整引物。
祝好!
2楼2014-02-24 21:55:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
目的条带大小有没有搞错---52℃10s?有没有考虑到酶的延伸速度?
学习使你立于不败之地
3楼2014-02-24 22:44:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-02-24 22:44:53
目的条带大小有没有搞错---52℃10s?有没有考虑到酶的延伸速度?

目的条带1400bp左右,有一篇相关文献的退火时间是10s,所以就一直用这个时间,这个温度了
4楼2014-02-25 18:14:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-24 21:55:18
1.查看模板来源,纯度、浓度是否够。
2.选择一个正对照,保证PCR系统没问题。
3. touch-down 或者二轮PCR,或许可以试试。
4. 可以考虑重新调整引物。
祝好!

1模板是新提的基因组,条带很清晰
2正对照是指?做一个16s PCR可以么
3我们PCR仪不支持touch down,直接拿PCR产物做模板进行二轮PCR?
4由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的
谢谢,期待进一步回复~
5楼2014-02-25 18:25:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjt2007

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能引物特异性不太好,可以重新设计引物试一次。好运!
Theworldisnotinyourbooksandmaps,itisoutthere.
6楼2014-02-25 18:25:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 18:14:08
目的条带1400bp左右,有一篇相关文献的退火时间是10s,所以就一直用这个时间,这个温度了...

你试试试延长到30s。文献上有些PCR程序别人拿过去不一定就是最佳的,只能作个参考;要么就是你的引物不好。
学习使你立于不败之地
7楼2014-02-25 19:03:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wang6rrtoy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议变性94℃  45s,褪火55℃  45s,可能是你这两个步骤的时间太短了,所以DNA复制的很少。同时Nanodrop看下模板的质量,依本人经验而言,一般PCR体系模板的浓度控制在1ng为好!
好好学习
8楼2014-02-25 19:15:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢伊莹

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by mjt2007 at 2014-02-25 18:25:19
可能引物特异性不太好,可以重新设计引物试一次。好运!

由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的,谢谢您的回复~
9楼2014-02-25 20:03:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mjt2007

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 20:03:25
由于目的基因序列不是很清楚,只能摸索引物,也用过兼并引物,这组引物算是筛选出的比较好的,谢谢您的回复~...

没有基因序列建议先克隆出这个基因。好运!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
Theworldisnotinyourbooksandmaps,itisoutthere.
10楼2014-02-26 04:49:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 谢伊莹 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 7K1CJE38xLG4 2026-08-25 4/200 2026-08-26 02:04 by cNXvBfCpiZOM
[基金申请] 明天应该可查了!? +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 19/950 2026-08-25 17:57 by chick875
[基金申请] 某些机构,以效率低为荣,以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +20 羊腰板 2026-08-21 23/1150 2026-08-25 16:34 by zsna
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 22/1100 2026-08-25 15:36 by 医学老男孩
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑,不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[教师之家] 导师吐槽:我怎么摊上了这么个极品研究生! +3 苏东坡二世 2026-08-23 3/150 2026-08-25 10:35 by shisan1313
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +7 炎黄贵胄 2026-08-22 8/400 2026-08-25 08:48 by ZJTJZ
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +25 yaoyewhu2008 2026-08-20 27/1350 2026-08-25 08:01 by Equinoxhua
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤?
[基金申请] 让我中一个面上吧! +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 时间戳今天,20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
信息提示
请填处理意见