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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带不清晰
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qhh835

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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11楼2014-02-26 07:24:45
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 18:25:00
1模板是新提的基因组，条带很清晰
2正对照是指？做一个16s PCR可以么
3我们PCR仪不支持touch down，直接拿PCR产物做模板进行二轮PCR？
4由于目的基因序列不是很清楚，只能摸索引物，也用过兼并引物，这组引物算 ...

正对照就是一定能扩增出来的产物。保证基因组和PCR程序的可信性。只要是组成表达的基因都行。
二轮PCR就是拿PCR产物做模板，最好在理论上大小的位置将胶切下回收。
但是引物要缩小一些范围，就是在你第一轮引物的内部再来一对，主要是为了排除非特异，再多扩增一些。有的PCR的产物很少，第二轮或许能看见。祝好。
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12楼2014-02-26 09:52:58
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谢伊莹

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by mjt2007 at 2014-02-26 04:49:37
没有基因序列建议先克隆出这个基因。好运！
...

明白，胶回收的图片这个水平，觉得回收不来，做不了克隆，您觉得可以回收么~
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13楼2014-02-26 21:08:05
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谢伊莹

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wang6rrtoy at 2014-02-25 19:15:51
建议变性94℃  45s，褪火55℃  45s，可能是你这两个步骤的时间太短了，所以DNA复制的很少。同时Nanodrop看下模板的质量，依本人经验而言，一般PCR体系模板的浓度控制在1ng为好！

如果DNA复制的少会造成这种类似弥散的状况？我也觉得变性和退火的时间和一般程序比太短了，打算试试延长时间~
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14楼2014-02-26 21:09:51
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谢伊莹

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wang6rrtoy at 2014-02-25 19:15:51
建议变性94℃  45s，褪火55℃  45s，可能是你这两个步骤的时间太短了，所以DNA复制的很少。同时Nanodrop看下模板的质量，依本人经验而言，一般PCR体系模板的浓度控制在1ng为好！

明白，我也觉得这两步的时间相对正常PCR程序有点太短，但是PCR程序短应该是条带不亮，能造成这种模糊状态么，想和大家多交流交流~
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15楼2014-02-26 21:16:39
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wang6rrtoy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-26 21:16:39
明白，我也觉得这两步的时间相对正常PCR程序有点太短，但是PCR程序短应该是条带不亮，能造成这种模糊状态么，想和大家多交流交流~...

你最下端的应该是引物二聚体。我做是时候有时也会有条带比较模糊的情况，建议你更换下电泳液。另外你电泳仪电流输出不稳也可能造成这种情况。以上都是我自己总结的，仅供你参考一下。。
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好好学习
16楼2014-02-26 22:23:21
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qiaozheng1

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-25 18:14:08
目的条带1400bp左右，有一篇相关文献的退火时间是10s，所以就一直用这个时间，这个温度了...

这个温度确实有点低，请参照酶的说明书

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17楼2014-02-27 00:15:22
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mjt2007

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 谢伊莹 at 2014-02-26 21:08:05
明白，胶回收的图片这个水平，觉得回收不来，做不了克隆，您觉得可以回收么~...

可以试试，克隆模板有一点就可以了。同时再从头重做一次。好运！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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Theworldisnotinyourbooksandmaps,itisoutthere.
18楼2014-02-27 07:27:07
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期待zcj

新虫 (初入文坛)
我也是遇到同样问题，一直在调试pcr反应体系
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19楼2014-02-27 10:32:32
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谢伊莹

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by qhh835 at 2014-02-26 07:24:45
鏄�?鏄叾鐨勬椿鎬э紝鎴戜互鍓?鍔犵殑閰堕�?灏戜細鍑虹幇杩欑�?鎯呭喌锛屼綘浠殑taq閰舵槸涓?鏄斁鏃堕棿闀夸簡

您回复的我看到的是乱码，如果方便，麻烦再回复一下，谢谢~
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20楼2014-02-27 20:48:33
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