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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » T载体上的酶切位点
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lingbi

银虫 (正式写手)

[求助] T载体上的酶切位点 已有3人参与

正在设计目的基因，上下游分别是EcoRI \BamHI ,请问，如果我将PCR产物连在T载体上送测序，回头再将目的片段切下来可不可以？看到T载上也有这两个位点会不会切下来的切多了连在表达载体上读码框移位之类的麻烦？请问大家怎么解决的？
T载体上的酶切位点
T.jpg
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1楼 2014-02-23 16:31:04
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-02-23 23:47:13
lingbi: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2014-02-24 12:15:38
...
    问题1. 可以T载体测序后再酶切连接目的载体 但其实最后在目的载体上测序比较合适
    问题2. 载体自有酶切位点的，很有可能会干扰你的酶切位点的酶切，所以请选用pMD19-T (simple)型T载体，此T载体没有MCS区域，或使用其他没有你酶切位点的T载体，如pGEM-T型就没有EcoRI和BamHI
    祝实验顺利
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Let God do with it as He wills
2楼2014-02-23 16:38:58
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lingbi: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-02-24 12:15:53
这个没有问题，酶切时间长些可以完全酶切这些片段不会影响下一步连接。
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hehe
3楼2014-02-23 19:15:01
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-23 23:47:20
lingbi: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-02-24 12:16:01
在T载体上测序确定正确之后再亚克隆比较好。这样可以保证PCR之后的产物是正确的。一般亚克隆不会改变目的基因的序列。而且酶切问题，只要酶切位点外侧有几个保护碱基，就会消化干净，所以此处不必担心酶切不完全的问题。祝顺利！
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4楼2014-02-23 20:37:00
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lingbi

银虫 (正式写手)
明白了，谢谢大家帮忙！
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5楼2014-02-24 12:16:56
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