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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR扩增曲线异常
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misszwh

银虫 (小有名气)

[求助] QPCR扩增曲线异常 已有7人参与

我有对引物，普通PCR并电泳检测，条带很亮，大小也是我需要的，到了QPCR上，溶解曲线正常，扩增曲线很奇怪，没有CT值，你们遇到过吗？什么原因啊？金币不多啊，悬赏有限啊谢谢
QPCR扩增曲线异常
amplication plot.jpg


QPCR扩增曲线异常-1
melt curve.jpg
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1楼 2014-02-19 22:09:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-20 08:25:54
1）浓度太高了；2）就没有进行PCR酶活性成了问题；3）说不清的因素。
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3楼2014-02-19 22:31:06
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jiaolong11a

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的PCR产物很小啊，溶解曲线不会是引物二聚体的吧
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多情总被无情扰。。。愁
6楼2014-02-20 08:35:32
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wangweijian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的荧光信号值好低，我做的一般都是100000以上的，应该是探针出了问题，换个探针试试，或者把荧光PCR产物跑下电泳看看有没有产物，有产物的话肯定是探针的问题。
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8楼2014-02-21 22:08:19
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普通回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-20 08:25:48
没遇到类似情况。
DNA电泳能看见条带，说明有产物。
溶解曲线还可以，但不是很尖锐，说明反应孔没有选错误。

会不会有污染？或者探针失效？
有没有正对照或负对照？结果都类似吗？
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2楼2014-02-19 22:21:38
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misszwh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-02-19 22:21:38
没遇到类似情况。
DNA电泳能看见条带，说明有产物。
溶解曲线还可以，但不是很尖锐，说明反应孔没有选错误。

会不会有污染？或者探针失效？
有没有正对照或负对照？结果都类似吗？

不会是污染的问题，我这对引物试了多次都是这个结果，内参引物的扩增是正常的。谢谢你的答复
赞一下 回复此楼
4楼2014-02-20 00:53:02
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misszwh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by forrestgump at 2014-02-19 22:31:06
1）浓度太高了；2）就没有进行PCR酶活性成了问题；3）说不清的因素。

我试了降低引物和模板的量，但是结果都一样。酶没有问题的。谢谢您的答复
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5楼2014-02-20 00:54:15
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misszwh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jiaolong11a at 2014-02-20 08:35:32
感觉你的PCR产物很小啊，溶解曲线不会是引物二聚体的吧

感觉是不大，但是二聚体的是不是没有这么大啊？
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7楼2014-02-21 10:00:11
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你看一下你的定量反应的循环温度延长时间有没有问题？我们实验室之前有个同学做定量选择fast reaction导致定量上没有扩增。
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hehe
9楼2014-02-22 20:04:52
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

...
    Melt curve中的值太低，绝度不是需要的扩增产物，引物二聚体的可能很大。你如果觉得有疑问，大可拿此产物跑2~3%的琼脂糖胶看一下，看看分子量大小。
    如有说错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
10楼2014-02-23 02:10:20
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