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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物，条带在槽里？
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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物，条带在槽里？

各位大神，求帮助，求解答。
我目的片段750bp，酶切链接转化到感受态JM109，平板上就长了几个菌落。
我挑菌，菌落PCR，酶用的是高保真酶KOD。
结果两次转化的所有PCR产物，两条带都在上样槽里。
MARKER，是DL2000，跑得很清楚。
求解答为什么？蛋白质污染？
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1楼2013-10-31 19:59:43
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-01 08:11:26
菌体量的话，你是怎么控制的？
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有，预变性是2min，下次我试试5min。...

枪头挑单菌落后洗在20ul水里面，然后取2ul做PCR模板，即可
变性时间一定是要5min
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-11-01 16:43:55
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:06
做菌落PCR不需要用KOD酶，KOD酶扩增能力不行，换taq酶PCR一次试试
同时注意：
1. 菌体量不能太大，太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min，这一步煮菌，释放DNA
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-10-31 21:05:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-01 01:58:27
林默泪: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:20
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。
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3楼2013-10-31 23:42:10
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林默泪

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-31 23:42:10
菌落PCR的模板很脏的，一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶，普通的taq就很好，扩增效率高而且便宜。

谢谢~
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4楼2013-11-01 08:09:23
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