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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 琼脂糖凝胶电泳转化子菌落PCR产物,条带在槽里?

各位大神,求帮助,求解答。
我目的片段750bp,酶切链接转化到感受态JM109,平板上就长了几个菌落。
我挑菌,菌落PCR,酶用的是高保真酶KOD。
结果两次转化的所有PCR产物,两条带都在上样槽里。
MARKER,是DL2000,跑得很清楚。
求解答为什么?蛋白质污染?
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 林默泪 at 2013-11-01 08:11:26
菌体量的话,你是怎么控制的?
我是用最小的枪头挑的单菌落。
还有,预变性是2min,下次我试试5min。...

枪头挑单菌落后洗在20ul水里面,然后取2ul做PCR模板,即可
变性时间一定是要5min
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-11-01 16:43:55
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
林默泪: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:06
做菌落PCR不需要用KOD酶,KOD酶扩增能力不行,换taq酶PCR一次试试
同时注意:
1. 菌体量不能太大,太大扩不出来
2. 预变性时间延长至5min,这一步煮菌,释放DNA
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-10-31 21:05:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-11-01 01:58:27
林默泪: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-11-04 16:17:20
菌落PCR的模板很脏的,一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶,普通的taq就很好,扩增效率高而且便宜。
3楼2013-10-31 23:42:10
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林默泪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-10-31 23:42:10
菌落PCR的模板很脏的,一般只用于鉴定。通常点样孔会有点亮。你的情况应该是没有P出来。菌落PCR完全没有必要用高保真酶,普通的taq就很好,扩增效率高而且便宜。

谢谢~
4楼2013-11-01 08:09:23
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