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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急！500kD 蛋白western 求助
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)

[求助] 急！500kD 蛋白western 求助

最近在做血浆中apoB的western，大小是520kD，浓缩胶5%，分离胶7% （150V，5h），感觉分的还可以，可转膜（350mA，5h）老是有问题。压出来的条带也不是很好看。有没有人做过的，求指导一下？
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1楼 2013-09-04 20:13:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanshuai511: 金币+10, ★有帮助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:21
楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形；甲醇对于高分子蛋白质可延长转移时间。
2.转移缓冲溶液中加入终浓度为0.1%的SDS，理由在8楼我已经说过了。
3.使用小孔径的NC膜，孔径0.2um的膜。
4.使用戊二醛交联蛋白质。上样后可以用戊二醛交联膜上的蛋白质，这样蛋白质自身构成的网络与NC膜的纤维网络会彼此交叉构成约束，使得NC膜上的蛋白质不易被洗下来。
5.对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。
6.适当增加转膜时间。
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13楼2013-09-06 22:16:42
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普通回帖

yanshuai511

铜虫 (小有名气)
急啊，没人做过吗？
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2楼2013-09-04 22:00:25
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是转过了还是？做个预实验看看试试电压和时间。可以适当提高甲醇浓度。

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2013-09-05 00:12:41
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在转膜液里加SDS可以帮助大蛋白转膜。此外条带不好看可能是变性不完全造成的，大蛋白变性比较困难，可以适当延长变性时间。
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4楼2013-09-05 01:40:38
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erlei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大蛋白比较难转，你可以尝试一下降低电压或电流，如果你的老板有钱的话可以买一台转膜机
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5楼2013-09-05 07:59:19
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by erlei at 2013-09-05 07:59:19
大蛋白比较难转，你可以尝试一下降低电压或电流，如果你的老板有钱的话可以买一台转膜机

转膜机够呛啊，降低电流估计时间又要摸索了。
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6楼2013-09-05 09:05:38
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-05 01:40:38
在转膜液里加SDS可以帮助大蛋白转膜。此外条带不好看可能是变性不完全造成的，大蛋白变性比较困难，可以适当延长变性时间。

变性我煮了15分钟，应该是可以了。
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7楼2013-09-05 09:07:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-05 15:22:07
对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。转膜实际上就是让蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙，所以蛋白质变成线状比较容易渗入到硝纤膜的纤维分子之间，因为空间位阻小，且不容易在掉下来，所以在转膜缓冲液中加入矢量浓度的SDS（可配置为：1L转膜缓冲液含0.37gSDS，这个浓度不可让蛋白质完全变为线状，不然会影响后面的免疫识别）使得蛋白质的空间构象变为线形比较容易操作成功。热变性的蛋白质的空间构象不是完全线形的，其中还存在很多的二级结构，尽管并非天然二级结构，但是仍然对于蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙会构成位阻效应，在大分子量的蛋白质中的热变性的非天然二级结构更多，所以位阻效应在转膜时更加明显。至于免疫反应那一步，抗体识别抗原的免疫决定簇有空间免疫决定簇也有序列免疫决定簇，一般只要不是蛋白质完全变为线形且无序列免疫决定簇，就不会没有免疫识别的现象出现。
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8楼2013-09-05 11:27:07
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

Mr为100kd以上的蛋白质当然要湿转法，可能我参与讨论实验问题时说的理论比较多，很多网友不适应。
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9楼2013-09-05 11:29:27
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xiwenhui

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
520的我没做过，500的我倒是做过几次，湿转就可以了，没问题的，多做几次就好了
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10楼2013-09-06 14:45:15
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