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yanshuai511铜虫 (小有名气)
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[求助]
急！500kD 蛋白western 求助
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| 最近在做血浆中apoB的western，大小是520kD，浓缩胶5%，分离胶7% （150V，5h），感觉分的还可以，可转膜（350mA，5h）老是有问题。压出来的条带也不是很好看。有没有人做过的，求指导一下？ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-05 15:22:07
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kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-09-05 15:22:07
| 对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。转膜实际上就是让蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙，所以蛋白质变成线状比较容易渗入到硝纤膜的纤维分子之间，因为空间位阻小，且不容易在掉下来，所以在转膜缓冲液中加入矢量浓度的SDS（可配置为：1L转膜缓冲液含0.37gSDS，这个浓度不可让蛋白质完全变为线状，不然会影响后面的免疫识别）使得蛋白质的空间构象变为线形比较容易操作成功。热变性的蛋白质的空间构象不是完全线形的，其中还存在很多的二级结构，尽管并非天然二级结构，但是仍然对于蛋白质进入硝纤膜的纤维分子之间的空隙会构成位阻效应，在大分子量的蛋白质中的热变性的非天然二级结构更多，所以位阻效应在转膜时更加明显。至于免疫反应那一步，抗体识别抗原的免疫决定簇有空间免疫决定簇也有序列免疫决定簇，一般只要不是蛋白质完全变为线形且无序列免疫决定簇，就不会没有免疫识别的现象出现。 |
8楼2013-09-05 11:27:07
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9楼2013-09-05 11:29:27
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【答案】应助回帖
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yanshuai511: 金币+10, ★有帮助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:21
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楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）： 1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形；甲醇对于高分子蛋白质可延长转移时间。 2.转移缓冲溶液中加入终浓度为0.1%的SDS，理由在8楼我已经说过了。 3.使用小孔径的NC膜，孔径0.2um的膜。 4.使用戊二醛交联蛋白质。上样后可以用戊二醛交联膜上的蛋白质，这样蛋白质自身构成的网络与NC膜的纤维网络会彼此交叉构成约束，使得NC膜上的蛋白质不易被洗下来。 5.对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。 6.适当增加转膜时间。 |
13楼2013-09-06 22:16:42
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14楼2013-09-06 22:19:26
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15楼2013-09-06 22:26:46
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17楼2013-09-06 23:26:09