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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 104KD的蛋白，做western blot电泳和转膜时间及膜的选择？
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)

[求助] 104KD的蛋白，做western blot电泳和转膜时间及膜的选择？

我现在要做一个104KD的蛋白，做western blot，想问一下电泳和转膜的电压电流和时间及膜的选择，是选PVDF膜还是NC膜？还有一抗二抗结合时间。
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1楼 2012-12-11 17:54:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lengjing1986

木虫 (正式写手)

博士

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-12-17 15:19:50
kittyamanda: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-21 11:43:24
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验，蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是：电泳：80V、30min 让蛋白压一压，平一点，这样你的带会比较好看；然后用100V跑电泳，大概一个半小时就差不多了，具体时间你可以通过Marker观察，电泳电压一定不要太大，否则产生的热量太多，蛋白带就不好看了。转膜过程，80V、100分钟，足够了。做不好找我。这实验很简单的。
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超越别人并不高贵，真实的高贵是超越过去的自己。
6楼2012-12-16 15:52:43
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-17 15:19:31
大蛋白转得慢一些，比你平时做一般蛋白多转一倍的时间就可以了。如果觉得太慢，适当加大一点电压电流。膜应该都可以吧。我比较喜欢PVDF。抗体结合时间应该与抗体效价有关，和蛋白分子量大小没什么关系吧。
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2楼2012-12-12 08:20:41
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
3楼2012-12-13 00:15:43
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luobugou

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PVDF膜，100V150min，一抗一般4度过夜，二抗室温1小时
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4楼2012-12-13 03:50:57
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escapezrj

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子量还好，0.45um的PVDF，10v稳压转50分钟，半干转。但是你蛋白峰度如何，是什么类型的蛋白呢
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5楼2012-12-13 19:50:24
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哈哈大姑爷

至尊木虫 (知名作家)
相互学习
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ＧＯ　ＯＮ
7楼2012-12-17 00:52:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-13 00:15:43
我在做108KD的蛋白，100V 1h，我总觉得我的蛋白转膜不够好。不知道你的条件是什么？

我一般是湿法转移70V，2h-2.5h。半干转移是稳流，电流=胶/膜的面积（平方厘米），1-1.5h。转膜效果可以用预染的marker查看。
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8楼2012-12-17 15:43:15
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议300 mA 1.5小时 湿法转膜。

记得一定要降温冰冷，否则发热很厉害。
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9楼2012-12-17 17:05:29
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by escapezrj at 2012-12-13 19:50:24
分子量还好，0.45um的PVDF，10v稳压转50分钟，半干转。但是你蛋白峰度如何，是什么类型的蛋白呢

那湿转的条件呢？蛋白丰度可以，表达量比较高。是编码蛋白，视网膜母细胞瘤蛋白。还有我用0.45um的NC膜应该也行吧？
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10楼2012-12-21 11:17:14
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