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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 104KD的蛋白，做western blot电泳和转膜时间及膜的选择？
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验，蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是：电泳：80V、30min 让蛋白压一压，平一点，这样你的带会比较好看；然后用100V跑电泳，大概一个半小时 ...

嗯非常感谢，遇到问题，再请教你。我第一次做这个蛋白，以前实验室也没人做这个，一抗的量很少，总共就100ul（很贵），具体稀释比例还没摸，我是要稀释一个梯度吗？怎样做才能用最少的量，最快的时间做出来？还有你说的那个转摸条件是湿转还是半干转？
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11楼2012-12-21 11:30:39
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-17 17:05:29
建议300 mA 1.5小时 湿法转膜。

记得一定要降温冰冷，否则发热很厉害。

300mA会不会太大啊？
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12楼2012-12-21 11:33:22
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 08:20:41
大蛋白转得慢一些，比你平时做一般蛋白多转一倍的时间就可以了。如果觉得太慢，适当加大一点电压电流。膜应该都可以吧。我比较喜欢PVDF。抗体结合时间应该与抗体效价有关，和蛋白分子量大小没什么关系吧。

抗体效价是一抗稀释比例吗？
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13楼2012-12-21 11:34:29
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-13 00:15:43
我在做108KD的蛋白，100V 1h，我总觉得我的蛋白转膜不够好。不知道你的条件是什么？

是没转过去还是转过了呢？
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14楼2012-12-21 11:35:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by kittyamanda at 2012-12-21 11:34:29
抗体效价是一抗稀释比例吗？...

抗体的效价是指抗体在一定缓冲液，一定温度和反应时间下与其相应抗原反应的多少。一抗稀释比例是根据抗体的效价来稀释的。
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15楼2012-12-21 13:04:46
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lvanmorison

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
16楼2012-12-21 15:53:07
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porphybaby

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by kittyamanda at 2012-12-21 11:33:22
300mA会不会太大啊？...

其实我也觉得有点大，但是时间短嘛，才1个半小时，这样也省时啊。

不过真的要注意降温，还有转膜液要配好。

建议外面拿个大盆子 装满冰~~然后把转膜槽放进去。

转膜槽里头建议也放一两个冰袋。其实这样还可以省一些转膜液，因为冰袋占体积~~
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17楼2012-12-22 09:37:13
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
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16楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-21 15:53:07
转的还行（看marker，以及显影的条带），就是有时候感觉条带不是很好看，不知道是转膜的问题，还是跑胶的问题。。...

前面有高手说，先用小电压跑一段时间，再换大电压跑，这样条带好看些。
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18楼2012-12-22 13:51:02
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验，蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是：电泳：80V、30min 让蛋白压一压，平一点，这样你的带会比较好看；然后用100V跑电泳，大概一个半小时 ...

你好我做了按照你说的条件，结果没做出结果……一抗我买的RB1单克隆抗体，就是验证买回来的这个抗体好不好用。他的说明书上没有说明稀释比例，也没有写效价，我就按照1:1000的比例稀释的。二抗我用的抗鼠，1:5000正常稀释的。下面有图帮我分析一下原因吧！谢谢
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19楼2013-01-08 19:55:58
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kittyamanda

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验，蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是：电泳：80V、30min 让蛋白压一压，平一点，这样你的带会比较好看；然后用100V跑电泳，大概一个半小时 ...

我不知道怎么插图，能给个邮箱什么的吗？方便请教
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20楼2013-01-08 19:56:37
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