24小时热门版块排行榜    

查看: 4727  |  回复: 21

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验,蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是:电泳:80V、30min 让蛋白压一压,平一点,这样你的带会比较好看;然后用100V跑电泳,大概一个半小时 ...

嗯非常感谢,遇到问题,再请教你。我第一次做这个蛋白,以前实验室也没人做这个,一抗的量很少,总共就100ul(很贵),具体稀释比例还没摸,我是要稀释一个梯度吗?怎样做才能用最少的量,最快的时间做出来?还有你说的那个转摸条件是湿转还是半干转?
11楼2012-12-21 11:30:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-17 17:05:29
建议300 mA 1.5小时 湿法转膜。

记得一定要降温冰冷,否则发热很厉害。

300mA会不会太大啊?
12楼2012-12-21 11:33:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 08:20:41
大蛋白转得慢一些,比你平时做一般蛋白多转一倍的时间就可以了。如果觉得太慢,适当加大一点电压电流。膜应该都可以吧。我比较喜欢PVDF。抗体结合时间应该与抗体效价有关,和蛋白分子量大小没什么关系吧。

抗体效价是一抗稀释比例吗?
13楼2012-12-21 11:34:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-13 00:15:43
我在做108KD的蛋白,100V 1h,我总觉得我的蛋白转膜不够好。不知道你的条件是什么?

是没转过去还是转过了呢?
14楼2012-12-21 11:35:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
13楼: Originally posted by kittyamanda at 2012-12-21 11:34:29
抗体效价是一抗稀释比例吗?...

抗体的效价是指抗体在一定缓冲液,一定温度和反应时间下与其相应抗原反应的多少。一抗稀释比例是根据抗体的效价来稀释的。
15楼2012-12-21 13:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvanmorison

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

16楼2012-12-21 15:53:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

porphybaby

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by kittyamanda at 2012-12-21 11:33:22
300mA会不会太大啊?...

其实我也觉得有点大,但是时间短嘛,才1个半小时,这样也省时啊。

不过真的要注意降温,还有转膜液要配好。

建议外面拿个大盆子 装满冰~~然后把转膜槽放进去。

转膜槽里头建议也放一两个冰袋。其实这样还可以省一些转膜液,因为冰袋占体积~~
17楼2012-12-22 09:37:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
16楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-21 15:53:07
转的还行(看marker,以及显影的条带),就是有时候感觉条带不是很好看,不知道是转膜的问题,还是跑胶的问题。。...

前面有高手说,先用小电压跑一段时间,再换大电压跑,这样条带好看些。
18楼2012-12-22 13:51:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验,蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是:电泳:80V、30min 让蛋白压一压,平一点,这样你的带会比较好看;然后用100V跑电泳,大概一个半小时 ...

你好我做了按照你说的条件,结果没做出结果……一抗我买的RB1单克隆抗体,就是验证买回来的这个抗体好不好用。他的说明书上没有说明稀释比例,也没有写效价,我就按照1:1000的比例稀释的。二抗我用的抗鼠,1:5000正常稀释的。下面有图帮我分析一下原因吧!谢谢
19楼2013-01-08 19:55:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittyamanda

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lengjing1986 at 2012-12-16 15:52:43
这么大的蛋白其实比较容易做的。我一直在做ubiquitination的实验,蛋白大小从70K-200K不等。我推荐给你的条件是:电泳:80V、30min 让蛋白压一压,平一点,这样你的带会比较好看;然后用100V跑电泳,大概一个半小时 ...

我不知道怎么插图,能给个邮箱什么的吗?方便请教
20楼2013-01-08 19:56:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kittyamanda 的主题更新
信息提示
请填处理意见