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yanshuai511

铜虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] 急！500kD 蛋白western 求助

最近在做血浆中apoB的western，大小是520kD，浓缩胶5%，分离胶7% （150V，5h），感觉分的还可以，可转膜（350mA，5h）老是有问题。压出来的条带也不是很好看。有没有人做过的，求指导一下？

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1楼 2013-09-04 20:13:19

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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专业: 生物大分子结构与功能
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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanshuai511: 金币+10, ★有帮助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩。 2013-09-10 10:48:21

楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形；甲醇对于高分子蛋白质可延长转移时间。
2.转移缓冲溶液中加入终浓度为0.1%的SDS，理由在8楼我已经说过了。
3.使用小孔径的NC膜，孔径0.2um的膜。
4.使用戊二醛交联蛋白质。上样后可以用戊二醛交联膜上的蛋白质，这样蛋白质自身构成的网络与NC膜的纤维网络会彼此交叉构成约束，使得NC膜上的蛋白质不易被洗下来。
5.对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。
6.适当增加转膜时间。