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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] western 中，目的蛋白没有，但是Marker 暴出来了，什么原因啊

各位虫友：
       我最近在做Western 实验，奇怪的是，目的蛋白没出来，Marker 和一些很大分子量的杂蛋白暴出来了，到底是什么原因啊？
       1. 我把ECL 染液滴到二抗上，它会发光，而且有杂蛋白暴出来，说明染液和二抗也没问题吧？      
       2.我在转膜后，用立春红对NC膜进行了染色，条带很清晰，对转膜后的凝胶用考马斯亮蓝进行染色，条带很弱， 说明我的转膜是成功的。
      3.我用1：1000的比例稀释一抗，在  4度下孵育过夜，第二天在孵育二抗，进行后续实验。
      4.在滴上显色液后，MARKER 位置上会显示很亮的荧光，可其余地方没有，就让我很奇怪。
       自己初学，没什么经验，希望得到大家的指导，谢谢
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1楼 2012-07-19 23:45:10
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-22 16:16:37
想请教下啊，我一直没搞懂MARKER 怎么可以出来呢？现在老师也老是揪住这个问题。...

的确，理论上marker是不能显影的，因为它不能与你的特异性很强的一抗反应。但marker也是蛋白，也就会存在与IgG抗体结合的可能性。有些公司生产的marker就明确指出可以和各类IgG抗体反应，以达到显影时出现marker条带的目的。如果你的一抗不纯，是多抗，特异性不好，或是反复用过很多次，谁也不敢保证不与marker反应从而显出条带来。所以我才会猜测你的一抗有可能失效了。嘿嘿，以上是我个人的理解，希望可以帮到你。祝实验顺利！！
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实验顺利！！
12楼2012-07-23 10:49:38
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-23 15:54:49
你的意思是如果二抗和MARKER混合后还能曝出来，那就说明marker的荧光不是和一抗结合如果曝不出来，就说明一抗和MARKER 结合了，那就说明是一抗特异性不强。那不管怎么弄，一抗问题比较大是吧？
嘿嘿 你的方法很不 ...

对，现在只是排除二抗和底物的问题，自创的方法，做梦梦到的，哈哈
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14楼2012-07-23 16:37:19
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普通回帖

84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 13:49:43
1：首先你使用的一抗是什么，说明书上应该有他的最佳稀释比例和孵育时间。
2.marker也有杂带，请问下你，使用封闭的方法是什么呢，是不是封闭出现了问题？
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2楼2012-07-20 11:50:50
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的Marker是带有标记的吗？如果不是，Marker怎么会发出荧光呢？你的Marker是污染了目的蛋白了吗？还有，你说的Marker发出荧光是什么样子的？条带还是糊成一片？ECL的底物如果能和二抗发生反应并产生荧光，说明这两个是没有问题的
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3楼2012-07-20 16:50:10
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
western出问题最可能就是你的一抗don't work。你的一抗是不是用过很多次了，或者失效了？另外western暴出MARKER来是很正常的现象，更能说明你的目的蛋白的抗体不是很好。
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实验顺利！！
4楼2012-07-20 20:02:07
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-20 11:50:50
1：首先你使用的一抗是什么，说明书上应该有他的最佳稀释比例和孵育时间。
2.marker也有杂带，请问下你，使用封闭的方法是什么呢，是不是封闭出现了问题？

我用的一抗是新买的兔抗人的TPA 的多克隆抗体，TPA 是我的目的蛋白，说明书只有稀释范围，没有孵育时间，这些都需要摸条件，但是现在的结果让我摸不着头绪。封闭是用5%的脱脂奶粉用TBST 稀释封闭的，常温下一小时，今天我已经多加了半小时，不知道明天结果怎么样，就是不明白问题出哪了呵呵
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5楼2012-07-20 23:21:19
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 16:50:10
你的Marker是带有标记的吗？如果不是，Marker怎么会发出荧光呢？你的Marker是污染了目的蛋白了吗？还有，你说的Marker发出荧光是什么样子的？条带还是糊成一片？ECL的底物如果能和二抗发生反应并产生荧光，说明这两 ...

我的MARKER没有带标记，只是普通的，只起指示作用，但就是把ECL 发光液滴上之后，MARKER 的位置会有亮亮的荧光，暴出来条带是模糊一片，其余就是杂蛋白比较多，我不太明白你说的Marker是污染了目的蛋白了？想讨教下这是怎么判断的？怎么避免呢，嘿嘿谢啦
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6楼2012-07-20 23:26:44
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-07-20 20:02:07
western出问题最可能就是你的一抗don't work。你的一抗是不是用过很多次了，或者失效了？另外western暴出MARKER来是很正常的现象，更能说明你的目的蛋白的抗体不是很好。

一抗是新买的，所以我纠结啊嘿嘿
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7楼2012-07-20 23:27:45
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-20 23:26:44
我的MARKER没有带标记，只是普通的，只起指示作用，但就是把ECL 发光液滴上之后，MARKER 的位置会有亮亮的荧光，暴出来条带是模糊一片，其余就是杂蛋白比较多，我不太明白你说的Marker是污染了目的蛋白了？想讨教下 ...

你的Marker位置怎么会发出荧光呢？是不是背景呀？我以前也是做出来整个模糊的一片，但是后来发现是一抗稀释倍数太高了，所以我降低了倍数之后就OK了，建议多试试
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8楼2012-07-21 17:41:37
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-21 17:41:37
你的Marker位置怎么会发出荧光呢？是不是背景呀？我以前也是做出来整个模糊的一片，但是后来发现是一抗稀释倍数太高了，所以我降低了倍数之后就OK了，建议多试试...

我也不明白Marker的位置怎么会有亮光，这个亮光应该是出现在目的蛋白处的，可为什么MARKER跟一抗结合了，而其余蛋白没有呢？昨天又做了次，MARKER位置是很清晰的条带，其余什么都没有，背景也很干净，真是纠结啊
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9楼2012-07-22 16:14:50
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ankang0910 at 2012-07-20 20:02:07
western出问题最可能就是你的一抗don't work。你的一抗是不是用过很多次了，或者失效了？另外western暴出MARKER来是很正常的现象，更能说明你的目的蛋白的抗体不是很好。

想请教下啊，我一直没搞懂MARKER 怎么可以出来呢？现在老师也老是揪住这个问题。
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10楼2012-07-22 16:16:37
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