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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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虫号: 1730658
注册: 2012-04-01

[求助] western 中，目的蛋白没有，但是Marker 暴出来了，什么原因啊

各位虫友：
   我最近在做Western 实验，奇怪的是，目的蛋白没出来，Marker 和一些很大分子量的杂蛋白暴出来了，到底是什么原因啊？
   1. 我把ECL 染液滴到二抗上，它会发光，而且有杂蛋白暴出来，说明染液和二抗也没问题吧？
   2.我在转膜后，用立春红对NC膜进行了染色，条带很清晰，对转膜后的凝胶用考马斯亮蓝进行染色，条带很弱，说明我的转膜是成功的。
   3.我用1：1000的比例稀释一抗，在  4度下孵育过夜，第二天在孵育二抗，进行后续实验。
   4.在滴上显色液后，MARKER 位置上会显示很亮的荧光，可其余地方没有，就让我很奇怪。
   自己初学，没什么经验，希望得到大家的指导，谢谢

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1楼 2012-07-19 23:45:10

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

ankang0910

金虫 (正式写手)

应助: 19 (小学生)
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专业: 医学免疫学

【答案】应助回帖

引用回帖:

10楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-22 16:16:37
想请教下啊，我一直没搞懂MARKER 怎么可以出来呢？现在老师也老是揪住这个问题。

...

的确，理论上marker是不能显影的，因为它不能与你的特异性很强的一抗反应。但marker也是蛋白，也就会存在与IgG抗体结合的可能性。有些公司生产的marker就明确指出可以和各类IgG抗体反应，以达到显影时出现marker条带的目的。如果你的一抗不纯，是多抗，特异性不好，或是反复用过很多次，谁也不敢保证不与marker反应从而显出条带来。所以我才会猜测你的一抗有可能失效了。嘿嘿，以上是我个人的理解，希望可以帮到你。祝实验顺利！！