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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] western 中,目的蛋白没有,但是Marker 暴出来了,什么原因啊

各位虫友:
       我最近在做Western 实验,奇怪的是,目的蛋白没出来,Marker 和一些很大分子量的杂蛋白暴出来了,到底是什么原因啊?
       1. 我把ECL 染液滴到二抗上,它会发光,而且有杂蛋白暴出来,说明染液和二抗也没问题吧?      
       2.我在转膜后,用立春红对NC膜进行了染色,条带很清晰,对转膜后的凝胶用考马斯亮蓝进行染色,条带很弱, 说明我的转膜是成功的。
      3.我用1:1000的比例稀释一抗,在  4度下孵育过夜,第二天在孵育二抗,进行后续实验。
      4.在滴上显色液后,MARKER 位置上会显示很亮的荧光,可其余地方没有,就让我很奇怪。
       自己初学,没什么经验,希望得到大家的指导,谢谢
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
western出问题最可能就是你的一抗don't work。你的一抗是不是用过很多次了,或者失效了?另外western暴出MARKER来是很正常的现象,更能说明你的目的蛋白的抗体不是很好。
实验顺利!!
4楼2012-07-20 20:02:07
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 13:49:43
1:首先你使用的一抗是什么,说明书上应该有他的最佳稀释比例和孵育时间。
2.marker也有杂带,请问下你,使用封闭的方法是什么呢,是不是封闭出现了问题?
2楼2012-07-20 11:50:50
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的Marker是带有标记的吗?如果不是,Marker怎么会发出荧光呢?你的Marker是污染了目的蛋白了吗?还有,你说的Marker发出荧光是什么样子的?条带还是糊成一片?ECL的底物如果能和二抗发生反应并产生荧光,说明这两个是没有问题的
3楼2012-07-20 16:50:10
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 84146922 at 2012-07-20 11:50:50
1:首先你使用的一抗是什么,说明书上应该有他的最佳稀释比例和孵育时间。
2.marker也有杂带,请问下你,使用封闭的方法是什么呢,是不是封闭出现了问题?

我用的一抗是新买的兔抗人的TPA 的多克隆抗体,TPA 是我的目的蛋白,说明书只有稀释范围,没有孵育时间,这些都需要摸条件,但是现在的结果让我摸不着头绪。封闭是用5%的脱脂奶粉用TBST 稀释封闭的,常温下一小时,今天我已经多加了半小时,不知道明天结果怎么样,就是不明白问题出哪了呵呵
5楼2012-07-20 23:21:19
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