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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)

[求助] western 中,目的蛋白没有,但是Marker 暴出来了,什么原因啊

各位虫友:
       我最近在做Western 实验,奇怪的是,目的蛋白没出来,Marker 和一些很大分子量的杂蛋白暴出来了,到底是什么原因啊?
       1. 我把ECL 染液滴到二抗上,它会发光,而且有杂蛋白暴出来,说明染液和二抗也没问题吧?      
       2.我在转膜后,用立春红对NC膜进行了染色,条带很清晰,对转膜后的凝胶用考马斯亮蓝进行染色,条带很弱, 说明我的转膜是成功的。
      3.我用1:1000的比例稀释一抗,在  4度下孵育过夜,第二天在孵育二抗,进行后续实验。
      4.在滴上显色液后,MARKER 位置上会显示很亮的荧光,可其余地方没有,就让我很奇怪。
       自己初学,没什么经验,希望得到大家的指导,谢谢
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你的Marker是带有标记的吗?如果不是,Marker怎么会发出荧光呢?你的Marker是污染了目的蛋白了吗?还有,你说的Marker发出荧光是什么样子的?条带还是糊成一片?ECL的底物如果能和二抗发生反应并产生荧光,说明这两个是没有问题的
3楼2012-07-20 16:50:10
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-20 23:26:44
我的MARKER没有带标记,只是普通的,只起指示作用,但就是把ECL 发光液滴上之后,MARKER 的位置会有亮亮的荧光,暴出来条带是模糊一片,其余就是杂蛋白比较多,我不太明白你说的Marker是污染了目的蛋白了?想讨教下 ...

你的Marker位置怎么会发出荧光呢?是不是背景呀?我以前也是做出来整个模糊的一片,但是后来发现是一抗稀释倍数太高了,所以我降低了倍数之后就OK了,建议多试试
8楼2012-07-21 17:41:37
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jl860822

金虫 (正式写手)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xingfuxiaoyu: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-23 15:44:45
引用回帖:
9楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-22 16:14:50
我也不明白Marker的位置怎么会有亮光,这个亮光应该是出现在目的蛋白处的,可为什么MARKER跟一抗结合了,而其余蛋白没有呢?昨天又做了次,MARKER位置是很清晰的条带,其余什么都没有,背景也很干净,真是纠结啊...

我教你,你这样,把你的二抗稀释然后和Marker混合,然后用与底物反应看看有没有荧光!这样试试可能会有效
11楼2012-07-22 19:36:40
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jl860822

金虫 (正式写手)


引用回帖:
13楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-23 15:54:49
你的意思是如果二抗和MARKER混合后还能曝出来,那就说明marker的荧光不是和一抗结合如果曝不出来,就说明一抗和MARKER 结合了,那就说明是一抗特异性不强。那不管怎么弄,一抗问题比较大是吧?
嘿嘿 你的方法很不 ...

对,现在只是排除二抗和底物的问题,自创的方法,做梦梦到的,哈哈
14楼2012-07-23 16:37:19
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jl860822

金虫 (正式写手)


然后你再单独试一下Marker,看看和底物反应能不能发荧光,估计肯定不行,我估计你中间哪一步可能弄错了,你多试试吧
16楼2012-07-25 22:33:01
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jl860822

金虫 (正式写手)


引用回帖:
15楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-25 21:48:50
在请教下啊,将ECL染液滴到二抗上,这两个要是没问题的话,肯定会发荧光啊,加了MARKER 肯定不会影响啊?...

然后你再单独试一下Marker,看看和底物反应能不能发荧光,估计肯定不行,我估计你中间哪一步可能弄错了,你多试试吧
17楼2012-07-25 22:33:38
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