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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western 中，目的蛋白没有，但是Marker 暴出来了，什么原因啊
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xingfuxiaoyu: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-23 15:44:45
引用回帖:
9楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-22 16:14:50
我也不明白Marker的位置怎么会有亮光，这个亮光应该是出现在目的蛋白处的，可为什么MARKER跟一抗结合了，而其余蛋白没有呢？昨天又做了次，MARKER位置是很清晰的条带，其余什么都没有，背景也很干净，真是纠结啊...

我教你，你这样，把你的二抗稀释然后和Marker混合，然后用与底物反应看看有没有荧光！这样试试可能会有效
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11楼2012-07-22 19:36:40
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ankang0910

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-22 16:16:37
想请教下啊，我一直没搞懂MARKER 怎么可以出来呢？现在老师也老是揪住这个问题。...

的确，理论上marker是不能显影的，因为它不能与你的特异性很强的一抗反应。但marker也是蛋白，也就会存在与IgG抗体结合的可能性。有些公司生产的marker就明确指出可以和各类IgG抗体反应，以达到显影时出现marker条带的目的。如果你的一抗不纯，是多抗，特异性不好，或是反复用过很多次，谁也不敢保证不与marker反应从而显出条带来。所以我才会猜测你的一抗有可能失效了。嘿嘿，以上是我个人的理解，希望可以帮到你。祝实验顺利！！
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实验顺利！！
12楼2012-07-23 10:49:38
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-22 19:36:40
我教你，你这样，把你的二抗稀释然后和Marker混合，然后用与底物反应看看有没有荧光！这样试试可能会有效...

你的意思是如果二抗和MARKER混合后还能曝出来，那就说明marker的荧光不是和一抗结合如果曝不出来，就说明一抗和MARKER 结合了，那就说明是一抗特异性不强。那不管怎么弄，一抗问题比较大是吧？
嘿嘿 你的方法很不错。
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13楼2012-07-23 15:54:49
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-23 15:54:49
你的意思是如果二抗和MARKER混合后还能曝出来，那就说明marker的荧光不是和一抗结合如果曝不出来，就说明一抗和MARKER 结合了，那就说明是一抗特异性不强。那不管怎么弄，一抗问题比较大是吧？
嘿嘿 你的方法很不 ...

对，现在只是排除二抗和底物的问题，自创的方法，做梦梦到的，哈哈
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14楼2012-07-23 16:37:19
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xingfuxiaoyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-23 16:37:19
对，现在只是排除二抗和底物的问题，自创的方法，做梦梦到的，哈哈...

在请教下啊，将ECL染液滴到二抗上，这两个要是没问题的话，肯定会发荧光啊，加了MARKER 肯定不会影响啊？
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15楼2012-07-25 21:48:50
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jl860822

金虫 (正式写手)
然后你再单独试一下Marker，看看和底物反应能不能发荧光，估计肯定不行，我估计你中间哪一步可能弄错了，你多试试吧
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16楼2012-07-25 22:33:01
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xingfuxiaoyu at 2012-07-25 21:48:50
在请教下啊，将ECL染液滴到二抗上，这两个要是没问题的话，肯定会发荧光啊，加了MARKER 肯定不会影响啊？...

然后你再单独试一下Marker，看看和底物反应能不能发荧光，估计肯定不行，我估计你中间哪一步可能弄错了，你多试试吧
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17楼2012-07-25 22:33:38
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