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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by xiwenhui at 2013-09-06 14:45:15
520的我没做过，500的我倒是做过几次，湿转就可以了，没问题的，多做几次就好了

能不能分享一下你做的时候的条件啊？
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11楼2013-09-06 21:44:33
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-05 11:27:07
对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。转膜实际上就是让蛋白质进入硝纤膜的纤 ...

两块膜是什么意思，难道是一块胶上放两块摸？
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12楼2013-09-06 21:47:53
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凌波丽

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanshuai511: 金币+10, ★有帮助 2013-09-08 13:52:36
myprayer: 金币+3, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:21
楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形；甲醇对于高分子蛋白质可延长转移时间。
2.转移缓冲溶液中加入终浓度为0.1%的SDS，理由在8楼我已经说过了。
3.使用小孔径的NC膜，孔径0.2um的膜。
4.使用戊二醛交联蛋白质。上样后可以用戊二醛交联膜上的蛋白质，这样蛋白质自身构成的网络与NC膜的纤维网络会彼此交叉构成约束，使得NC膜上的蛋白质不易被洗下来。
5.对于大分子量的蛋白质，转膜时电压要高一点，一般 恒压100V，限流400mA，时间也要延长一点，比3小时要长，开始最好也用两块膜，注意加强降温措施，在槽的一边放一块冰来降温。
6.适当增加转膜时间。
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13楼2013-09-06 22:16:42
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凌波丽

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【答案】应助回帖

引用回帖:
12楼: Originally posted by yanshuai511 at 2013-09-06 21:47:53
两块膜是什么意思，难道是一块胶上放两块摸？...

一块胶上放一块膜，原话录入错了。sorry！
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14楼2013-09-06 22:19:26
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凌波丽

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引用回帖:
12楼: Originally posted by yanshuai511 at 2013-09-06 21:47:53
两块膜是什么意思，难道是一块胶上放两块摸？...

不好意思，录入时是想着组装成转膜夹子时，依次放上衬垫两层滤纸、电泳凝胶、NC膜、着两层滤纸、衬垫的顺序。。。当时正好被别人打断了一下，接着往下写就写错了。
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15楼2013-09-06 22:26:46
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-06 22:26:46
不好意思，录入时是想着组装成转膜夹子时，依次放上衬垫两层滤纸、电泳凝胶、NC膜、着两层滤纸、衬垫的顺序。。。当时正好被别人打断了一下，接着往下写就写错了。...

我们实验室现在用的都是PVDF膜，0.45μm的，我看了说明书好像也可以做大分子的蛋白。其余的转膜的改进方法，除了没加SDS之外，其余的我都试过了。那就加上SDS再试试。谢谢了！
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16楼2013-09-06 23:20:26
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凌波丽

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【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-10 10:48:05
其他改进条件你可以分梯度进行。Good Luck!
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17楼2013-09-06 23:26:09
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yanshuai511

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-06 22:16:42
楼主说的如果是转移蛋白质到膜上的效率低，那么可以有如下解决方法（湿转）：
1.转移缓冲溶液中加入终浓度为20%的甲醇溶液，甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但是增加蛋白质与NC膜的结合能力；甲醇可以防止凝胶变形； ...

你好！你说的转膜液里加0.1%的SDS，那为什么1L转膜液只加0.37
g呢？
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18楼2013-11-11 19:58:43
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