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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关嗜热蛋白纯化的问题
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 有关嗜热蛋白纯化的问题

各位虫友：我现在在做蛋白纯化。
先介绍一下我的蛋白:我做的蛋白是一种嗜热蛋白，在100℃下还能保持很好的活性。所以就想通过煮蛋白的方式，使杂蛋白变性沉淀下去，而上清中只保留 我自己的目标蛋白。但是现在我不管怎么煮在距离目标蛋白很近的位置总有杂蛋白存在，怎么煮都煮不干净。我的宿主菌是大肠杆菌（rossetta），按说大肠杆菌是不会有嗜热的蛋白存在的，怎么会除不干净呢？有用过这种纯化蛋白的虫友 们能否借鉴一些纯化经验啊！小虫将不甚感激！
下面附纯化蛋白电泳图一张：
有关嗜热蛋白纯化的问题
纯化蛋白.jpg
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nothing isimpossible
1楼 2013-07-27 21:10:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan(myprayer代发): 金币+1, 鼓励应助，热心的顾问分子生物期待更多精彩 2013-07-27 23:58:50
hraikeyan: 金币+3, ★★★很有帮助, 我的蛋白上没有标签，因为它是嗜热的想着煮一下就纯化干净了，所以没有加标签。我之前也跑过空大肠的，空大肠也是有这条条带的。 2013-07-28 09:14:53
确定下面的小带一定是杂蛋白吗？某些蛋白在SDS-PAGE上会跑出这样的带来，可能是蛋白有结合辅因或者有修饰造成迁移率不同。你的重组蛋白上有带标签吧，你可以做一下western检查是否两条带都是目的蛋白。
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2楼2013-07-27 23:25:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
hraikeyan(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-28 17:15:52
你指把空的大肠杆菌样品煮后也有这条带？那么说明可能是大肠杆菌本身有的耐热蛋白了。如果你要求样品很纯，可以试试盐析或者离子交换纯化。
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3楼2013-07-28 11:10:50
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-07-29 09:38:55
建议加his-tag。单纯靠煮，重复性也不太好。我前几天刚做过一个嗜热酶。开始加N-标记的his-tag不挂柱，试图用煮的方法，可重复性不好。后来换成C-标记就ok了。
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4楼2013-07-28 22:42:16
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-07-28 22:42:16
建议加his-tag。单纯靠煮，重复性也不太好。我前几天刚做过一个嗜热酶。开始加N-标记的his-tag不挂柱，试图用煮的方法，可重复性不好。后来换成C-标记就ok了。

请问在加入his-tag后，在蛋白纯化后需要把his-tag切掉吗？
我之前也建议老师加his-tag，但是老师说这样纯化出来的蛋白就不是纯天然的蛋白了，可能会改变它的性质。
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nothing isimpossible
5楼2013-07-29 09:40:25
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1 2013-07-30 13:58:53
His-tag可以切掉也可以不切掉，看活性和实验需求
需要切掉的话，就是加上EK酶切位点，切后蛋白序列和天然的一样。
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6楼2013-07-29 15:47:34
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by hraikeyan at 2013-07-29 09:40:25
请问在加入his-tag后，在蛋白纯化后需要把his-tag切掉吗？
我之前也建议老师加his-tag，但是老师说这样纯化出来的蛋白就不是纯天然的蛋白了，可能会改变它的性质。...

不需要切掉，我们做的酶活分析，都使用histag，基本不影响活性。
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7楼2013-07-29 17:34:16
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-07-29 17:34:16
不需要切掉，我们做的酶活分析，都使用histag，基本不影响活性。...

还有个问题：其实我这个酶在破碎时就遇到问题，怎么破都破不开，全细胞活性很高，破碎沉淀活性很高，上清就很低。但是即使再增加破碎功率，使破碎上清的活性最多也达到80%。破电泳上清条带很暗，沉淀一大堆。想着这应该不是包涵体吧，毕竟沉淀是有活性的。您看这种情况是包涵体吗？
还有就是我想着毕竟上清还是有活性的，就想着多养些菌，多攒一些上清的蛋白，来做酶学性质，您说这样可以吗？
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nothing isimpossible
8楼2013-07-30 09:14:49
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-07-29 17:34:16
不需要切掉，我们做的酶活分析，都使用histag，基本不影响活性。...

还有一个问题，我这个蛋白全细胞活性很高，破碎沉淀活性很高，但就是破碎上清活性很低，最后通过增加破碎功率和时间，使得破碎上清的活性达到80%，但是跑电泳，上清的条带还是很少，沉淀一大堆。请问这是不是包涵体啊？毕竟全细胞活性很高。
还有一个问题，我想即使上清蛋白少多样些菌，多攒些蛋白，也可以进行酶学性质研究，您看这行吗？
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nothing isimpossible
9楼2013-07-30 09:22:31
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2013-07-29 17:34:16
不需要切掉，我们做的酶活分析，都使用histag，基本不影响活性。...

再附一张破碎前后电泳图：
单数：破碎上清；
双数：破碎沉淀
有关嗜热蛋白纯化的问题-1
破碎前后.jpg
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nothing isimpossible
10楼2013-07-30 09:46:09
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