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hraikeyan

金虫 (小有名气)

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[求助] 有关嗜热蛋白纯化的问题

各位虫友：我现在在做蛋白纯化。
先介绍一下我的蛋白:我做的蛋白是一种嗜热蛋白，在100℃下还能保持很好的活性。所以就想通过煮蛋白的方式，使杂蛋白变性沉淀下去，而上清中只保留我自己的目标蛋白。但是现在我不管怎么煮在距离目标蛋白很近的位置总有杂蛋白存在，怎么煮都煮不干净。我的宿主菌是大肠杆菌（rossetta），按说大肠杆菌是不会有嗜热的蛋白存在的，怎么会除不干净呢？有用过这种纯化蛋白的虫友们能否借鉴一些纯化经验啊！小虫将不甚感激！
下面附纯化蛋白电泳图一张：

纯化蛋白.jpg

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nothing isimpossible

1楼2013-07-27 21:10:53

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
hraikeyan(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-28 17:15:52

你指把空的大肠杆菌样品煮后也有这条带？那么说明可能是大肠杆菌本身有的耐热蛋白了。如果你要求样品很纯，可以试试盐析或者离子交换纯化。

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3楼2013-07-28 11:10:50

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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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虫号: 1614001
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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan(myprayer代发): 金币+1, 鼓励应助，热心的顾问分子生物期待更多精彩 2013-07-27 23:58:50
hraikeyan: 金币+3, ★★★很有帮助, 我的蛋白上没有标签，因为它是嗜热的想着煮一下就纯化干净了，所以没有加标签。我之前也跑过空大肠的，空大肠也是有这条条带的。 2013-07-28 09:14:53

确定下面的小带一定是杂蛋白吗？某些蛋白在SDS-PAGE上会跑出这样的带来，可能是蛋白有结合辅因或者有修饰造成迁移率不同。你的重组蛋白上有带标签吧，你可以做一下western检查是否两条带都是目的蛋白。

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2楼2013-07-27 23:25:13

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