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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我的PCR电泳图，求高手指点
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)

[求助] 我的PCR电泳图，求高手指点

这张图片是我跑的PCR电泳图,试剂用量
dNTP:5uL,
10*Buffer5uL.
Mg2+:4uL.
Template:0.5uL.
Primer（F/R）:1uL.
Enzyme(上海生工):1uL.
ddH2O:32.5uL.
我的PCR电泳图，求高手指点
2013-6-23-2.jpg
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learn to smile at life~~
1楼 2013-06-23 21:03:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2013-06-24 07:54:08
没有标明各种母液的浓度和酶的种类，不好判断浓度是否合适。还有，最好能说明模板是什么，有没有定量？PCR产物的大小是多少，引物的Tm值是多少，PCR程序怎样设置的。
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2楼2013-06-24 06:23:45
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 同意 2013-06-24 07:54:46
1949stone: 回帖置顶 2013-06-24 07:54:48
你的条带不太均一，没有marker，图也不清楚，说不太好。不知道你用的什么酶，降低镁离子浓度也许有帮助。另，反应体系降到25微升试试，反应体系小，温度也会精确一些。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-06-24 07:24:54
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langduiyue

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
LZ做的单重多重PCR呀？
给体积没用的， 要具体用量，  例如： 引物多少pMol,  镁离子 多少 mMol
建议先查看引物如何， 有无二级结构， 有无非特异位点， 引物OK 成功一半
引物OK 做个温度梯度，查找合适退火温度
如效果不佳， 最对试剂用量， 反应条件，做调整。

记得一定要有 阳性和阴性对照
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角逐自我
4楼2013-06-24 10:57:16
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)
谢谢各位指点，dNTP:5uL,（0.25mM）
10*Buffer5uL.
Mg2+:4uL.(2mM)
Template:0.5uL.(--10ng)
Primer（F/R）:1uL.
Enzyme(上海生工Taq):1uL.(2.5u)
ddH2O:32.5uL.
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learn to smile at life~~
5楼2013-06-25 11:13:46
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chunfengxiyu at 2013-06-25 11:13:46
谢谢各位指点，dNTP:5uL,（0.25mM）
10*Buffer5uL.
Mg2+:4uL.(2mM)
Template:0.5uL.(--10ng)
Primer（F/R）:1uL.
Enzyme(上海生工Taq):1uL.(2.5u)
ddH2O:32.5uL.

目的片段是500bp
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learn to smile at life~~
6楼2013-06-25 11:15:40
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)
95 5min,
95  30s
56.5 30s
72 35s
72 10min
4   forever
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learn to smile at life~~
7楼2013-06-25 11:18:05
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by langduiyue at 2013-06-24 10:57:16
LZ做的单重多重PCR呀？
给体积没用的， 要具体用量，  例如： 引物多少pMol,  镁离子 多少 mMol
建议先查看引物如何， 有无二级结构， 有无非特异位点， 引物OK 成功一半
引物OK 做个温度梯度，查找合适退火温 ...

引物是老师设计好给的，直接用的，具体信息不清楚，老实说实在不行就做个T载体连接，提质粒，再PCR，电泳。。。
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learn to smile at life~~
8楼2013-06-25 11:22:48
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chunfengxiyu

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-06-24 07:24:54
你的条带不太均一，没有marker，图也不清楚，说不太好。不知道你用的什么酶，降低镁离子浓度也许有帮助。另，反应体系降到25微升试试，反应体系小，温度也会精确一些。
...

奥，最右边的是Marker，其中比较亮的是500bp的和1000bp的
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learn to smile at life~~
9楼2013-06-25 11:24:21
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chunfengxiyu: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-25 21:53:15
胶的浓度，跑胶的时间可能不太少，建议浓度大点，时间长点。mark没跑开，，模板浓度小一点。。
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10楼2013-06-25 11:24:43
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