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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，跪求分析下PCR失败原因
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myfriendtl

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，跪求分析下PCR失败原因

跪求高手指点一下，为什么我的PCR产物电泳图这个样子。引物是通用引物27F和1492r
体系25ul，buffer：2.5，dntp：2，引物：0.5，模板0.5，taq酶天根的（5U）0.2ul
预变性94℃，4min
变性94℃，40s
退火56℃，1min
延伸72℃，1.5min
三十个循环
之后72℃，10min

Administrator 2013-01-09 15 小时 37 分钟.jpg
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1楼 2013-01-16 15:09:17
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121however

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-16 20:28:12
amisking: 回帖置顶 2013-01-16 20:28:14
看你的marker应该是胶的问题吧，重新做个胶试试，加上eb后一定要混匀。另外退火时间是不是有点长啊
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3楼2013-01-16 15:22:06
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普通回帖

reninhat

铁杆木虫 (正式写手)
没有荧光扩增图么？光看电泳图不好分析啊
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2楼2013-01-16 15:14:45
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myfriendtl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by reninhat at 2013-01-16 15:14:45
没有荧光扩增图么？光看电泳图不好分析啊

没有啊，pcr这东西我也是刚做，结果各种问题
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4楼2013-01-16 15:22:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的什么模板，是不是用量太大了。条带是要扩增的片段大小吗？
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5楼2013-01-16 16:13:24
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myfriendtl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-16 16:13:24
用的什么模板，是不是用量太大了。条带是要扩增的片段大小吗？

细菌的总DNA，用天根的试剂盒提取的。取得0.5uL。条带是16s扩增的
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6楼2013-01-16 16:23:46
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板浓度太高，先稀释十倍扩看看，上面的基因组条带都看得见了
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7楼2013-01-17 06:11:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by myfriendtl at 2013-01-16 16:23:46
细菌的总DNA，用天根的试剂盒提取的。取得0.5uL。条带是16s扩增的...

提的总DNA一般浓度比较高，细菌PCR的模板一般加几ng就可以了，如果不能定量，最好做一下稀释梯度。
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8楼2013-01-17 08:37:42
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白风

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模版浓度高，另外你的有些孔道有条带，有些孔道没有，各个孔道都是什么，哪些是你要扩增的?
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9楼2013-01-17 09:56:37
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myfriendtl

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 白风 at 2013-01-17 09:56:37
模版浓度高，另外你的有些孔道有条带，有些孔道没有，各个孔道都是什么，哪些是你要扩增的?

这几个都是，没有东西的几个，是没扩出来的。扩出来的以marker为界分别是两种菌
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10楼2013-01-17 10:09:30
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