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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » real-time引物设计问题，关于保守取，内含子
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fanwq258

木虫 (正式写手)

[求助] real-time引物设计问题，关于保守取，内含子

real-time引物设计问题，怎么弄么？说的是要在保守区设计，但是保守取是那部分呢？怎么找？还有就是要跨内含子……怎么知道哪儿有内含子啊
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
1楼 2013-03-30 11:33:05
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回帖置顶 ( 共有2个 )

chnfhjxl

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 应助指数+1, 赠人玫瑰手有余香。鼓励应助 2013-04-01 22:38:51
fanwq258: 金币+10, ★有帮助 2013-04-02 09:44:51
gyesang: 回帖置顶 2013-04-26 21:25:29
NCBI上每个核酸序列信息的旁边有个Pick Primer 点进去，把你自己设计好的引物输进去，然后看看结果是不是跨内含子的。不过要求的跨内含子是针对RNA表达量检测的。如果是检测菌的数量等DNA水平的话，就不需要了。至于所谓的保守，我就不清楚了，你的试验目的不同，real time 的引物要求也不同的。不要死扣那些引物设计规则。祝你好运吧
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2楼2013-03-30 12:05:01
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chnfhjxl

金虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 回帖置顶 2013-05-31 18:06:59
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 18:07:04
引用回帖:
3楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-03-30 21:55:44
NCBI上看不到跨内含子啊？怎么弄...

序列下面有红色的区域，红色的是蛋白质编码区，也就是外显子区域，然后去查查这个基因DNA的信息，就知道是不是跨内含子了。一般在外显子区域内的大多都可以跨内含子了。
其实所谓跨内含子只不过是为了防止你RNA 中含有DNA。其实最简单的办法是在RNA提取后加DNA酶消化过程，或者做一个不反转录直接PCR的对照，如果也P的出来就说明你的荧光定量要用跨内含子的引物了。
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5楼2013-03-31 12:17:22
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chnfhjxl at 2013-03-30 12:05:01
NCBI上每个核酸序列信息的旁边有个Pick Primer 点进去，把你自己设计好的引物输进去，然后看看结果是不是跨内含子的。不过要求的跨内含子是针对RNA表达量检测的。如果是检测菌的数量等DNA水平的话，就不需要了。至于 ...

NCBI上看不到跨内含子啊？怎么弄
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3楼2013-03-30 21:55:44
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stt19890101

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不用考虑吧  我们设计的时候就没有考虑过。你说的跨内含子具体是什么意思呢
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4楼2013-03-31 09:54:37
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chnfhjxl at 2013-03-31 12:17:22
序列下面有红色的区域，红色的是蛋白质编码区，也就是外显子区域，然后去查查这个基因DNA的信息，就知道是不是跨内含子了。一般在外显子区域内的大多都可以跨内含子了。
其实所谓跨内含子只不过是为了防止你RNA 中 ...

那引物应该在那部分设计呢？cDNA有2000多bp，而只扩200bp左右。
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6楼2013-03-31 13:44:00
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fanwq258

木虫 (正式写手)
7楼2013-04-01 18:33:20
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-26 21:26:02
你先在NCBI上找到该基因的DNA序列，然后再找他的mRNA序列  两个一比较就可以找到每一个外显子的序列，设计引物建议选择在两个外显子连接处设计（这样可以保证有DNA污染的情况下也不结合到DNA上），可以增加特异性。
有的人说扩约一个内含子，但这种效果不是很好（因为及时你跨越了一个内含子，但是上下游引物刚好在两个相邻的外显子上，刚好跨越的那个内含子大小又<150bp,那么有DNA污染的情况下你还是能够扩增出条带，不特意了就）
希望对你有帮助  我前两天刚设计
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8楼2013-04-02 10:05:31
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-04-02 10:05:31
你先在NCBI上找到该基因的DNA序列，然后再找他的mRNA序列  两个一比较就可以找到每一个外显子的序列，设计引物建议选择在两个外显子连接处设计（这样可以保证有DNA污染的情况下也不结合到DNA上），可以增加特异性。 ...

那一段cDNA中有跨好多个内含子，怎么取舍呢？
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9楼2013-04-02 10:47:01
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意孤城_

金虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-03 17:59:28
引用回帖:
9楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-04-02 10:47:01
那一段cDNA中有跨好多个内含子，怎么取舍呢？...

我没看懂你什么意思。有的基因的转录本有差异就会有好几种不同的外显子构型（比如有的是包含10个外显子，有的却是包含8个外显子）那么最好选择共有那部分外显子上设计引物。一段cDNA上肯定包含很多个外显子就必然会有很多个内含子对应在DNA上，这个选哪个影响倒不是很大，如我刚才说的。如果没有合适的跨越外显子连接处的引物可以考虑跨一个大于1000bp以上的内含子（PCR是延伸时间比较短，这样即使有DNA污染，结合到DNA上由于延伸时间问题也不会出现杂带）
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10楼2013-04-02 20:36:24
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