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RACE的引物设计问题
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| 鄙人要扩增一个基因全长，目前已将中间片段扩增出来了，结果如下：ATGAGTCTTAGAGGACTGGGTGTAGATCCACGCTGTCGCTGCATTGAAACTGAGAGTCGACGCATTGGAAAACACATAGAGAGTGTGGAGCTCTTCCCTCCAAACTCACACTGTAAAGACACAGAGATCATTGCAACCCTGAAGATAACTGGGAAAGAGATCTGTCTGGACCCTACTGCACCCTGGGTTAAGAAAGTCAT 。请问各位大侠，如何根据这个中间片段设计3‘RACE和5’RACE引物，进行3‘RACE和5’RACE扩增？ |
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free_zi
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2楼2012-07-21 18:12:05
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yananhl
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小丹木木: 金币+3, 鼓励积极分享经验 2012-07-23 15:46:36
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极分享经验 2012-07-23 15:46:36
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正好最近也在做，和lz分享一下经验吧。 1、长度大概23-28nt。不用太长，没啥用。 2、高tm，尽量tm值高于65度，能上70也行，便于后边使用降落PCR。 3、gc含量尽量接近50或更高。 4、推荐使用pp5和oligo6，前者搜索，后者检测，虽然tm值相差会很大（pp5计算方法不如oligo精细），但无伤大雅。 5、也可手动设计，就是单用oligo，寻找tm较高的区域，手动调整。 6、如果片段较短，建议先进行3’，相对简单。之后得到3‘片段了，再在拼接起来的长片段上设计5’GSP。原因是5‘一般用试剂盒，对引物要求较高，尤其是用TAKARA的，如果引物设计不好，就是烧钱，片段长点，引物设计的选择余地就大。 望对lz有用！ |
6楼2012-07-23 09:40:05
free_zi
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7楼2012-07-25 11:27:58
yananhl
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