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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RACE的引物设计问题
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zibeisha

木虫 (著名写手)

[求助] RACE的引物设计问题

鄙人要扩增一个基因全长，目前已将中间片段扩增出来了，结果如下：ATGAGTCTTAGAGGACTGGGTGTAGATCCACGCTGTCGCTGCATTGAAACTGAGAGTCGACGCATTGGAAAACACATAGAGAGTGTGGAGCTCTTCCCTCCAAACTCACACTGTAAAGACACAGAGATCATTGCAACCCTGAAGATAACTGGGAAAGAGATCTGTCTGGACCCTACTGCACCCTGGGTTAAGAAAGTCAT 。请问各位大侠，如何根据这个中间片段设计3‘RACE和5’RACE引物，进行3‘RACE和5’RACE扩增？
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有时我们无奈，有时我们迷茫，可是不管怎样，只要我们积极生活，命运就不会亏待我们。
1楼 2012-07-21 11:48:00
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free_zi

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解决问题！ 2012-07-21 22:13:40
首先， 应确定该中间片段在全长中的大概位置，距离5‘端和3’端大概还有多长？
其次，你是否建有全长的race文库？
最后，如果中间片段距离5‘和3’大小合适的话，直接依据中间序列设计完全匹配引物，以RACE文库为模板扩增即可
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2楼2012-07-21 18:12:05
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xmchen1015

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
只要保证3`RACE，5`RACE扩增完后，两都之间有重叠区就可以，再就是注意设计的引物Tm值。
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3楼2012-07-21 20:09:47
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by free_zi at 2012-07-21 18:12:05
首先， 应确定该中间片段在全长中的大概位置，距离5‘端和3’端大概还有多长？
其次，你是否建有全长的race文库？
最后，如果中间片段距离5‘和3’大小合适的话，直接依据中间序列设计完全匹配引物，以RACE文库为 ...

如果扩出来的是单条带，但不是自己所要的基因是怎么回事呢？引物的问题吗？应该怎么设计呢？
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4楼2012-07-22 19:44:57
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凤凰-涅磐

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高中学的真是小菜一碟，同情你。为你加油，相信你自己，可以做出来
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吃得苦中苦，方为人上人
5楼2012-07-22 20:01:23
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极分享经验 2012-07-23 15:46:36
正好最近也在做，和lz分享一下经验吧。
1、长度大概23-28nt。不用太长，没啥用。
2、高tm，尽量tm值高于65度，能上70也行，便于后边使用降落PCR。
3、gc含量尽量接近50或更高。
4、推荐使用pp5和oligo6，前者搜索，后者检测，虽然tm值相差会很大（pp5计算方法不如oligo精细），但无伤大雅。
5、也可手动设计，就是单用oligo，寻找tm较高的区域，手动调整。
6、如果片段较短，建议先进行3’，相对简单。之后得到3‘片段了，再在拼接起来的长片段上设计5’GSP。原因是5‘一般用试剂盒，对引物要求较高，尤其是用TAKARA的，如果引物设计不好，就是烧钱，片段长点，引物设计的选择余地就大。
望对lz有用！
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6楼2012-07-23 09:40:05
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free_zi

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yananhl at 2012-07-22 19:44:57
如果扩出来的是单条带，但不是自己所要的基因是怎么回事呢？引物的问题吗？应该怎么设计呢？...

应该是引物的问题，可能是引物和别的序列配对扩增，可以换个位置设计引物，同时尽量让引物的退火温度高一点，这样可以保证扩增时的特异性
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7楼2012-07-25 11:27:58
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by free_zi at 2012-07-25 11:27:58
应该是引物的问题，可能是引物和别的序列配对扩增，可以换个位置设计引物，同时尽量让引物的退火温度高一点，这样可以保证扩增时的特异性...

别人说做5'不用试剂盒的话，片断越短越好，不超过500最好，而且引物设计最好不要在保守片断内，我所做的基因5‘端是不到500，但是却在保守片断内，如果不在保守片断内就长于1000bp了。纠结了。做出来多条带是不是退火温度太低了，我用的退火温度是55度。
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8楼2012-07-25 11:33:07
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